（7）计算最终的血球量使浓度达到完全压缩后的1%，取所需洗好马血球的体积加入PBS-0.5% BSA 中，每次用前轻轻混匀后使用。
3. 制备用于红细胞凝集抑制试验的4 个红细胞凝集单位的抗原
（1）将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1 称为第一列；平行方向称行，如A1～A12 称为A 行。标记好标准诊断抗原及加样顺序。
1）吸取50μL PBS 加入微量板的第二列至最后一列，于第一列加入100μL标准诊断病毒。2）从第一列取50μL 病毒液，依次从第二列至第八列做2 倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μL 稀释后的病毒液。
3）每孔加入50μL 1%的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。
4）室温孵育45～60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。
5）结果判定：红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。红细胞完全凝集以“＋”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。
（2）制备4 个红细胞凝集抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8 孔稀释，每孔用抗原25μL 抗原，那么测定一份血清需0.2mL 抗原。根据参比血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原。
（3）计算出病毒稀释度。用病毒红细胞凝集滴度（HA 滴度）除以8，得到的商即为4 个红细胞凝集单位的稀释度。如，某病毒的HA 滴度为64，除以8 等于8。按1：8（1mL 病毒液加7mL PBS）稀释该病毒即可得到4 个凝集单位/25μL的抗原病毒量。
（4）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4 个凝集单位抗原须复核滴定：取50μL 稀释好的抗原，用等量PBS 做倍比稀释（同病毒滴定）后加入50μL 红细胞悬液，至室温孵育45～60min 后观察凝集结果。如只有前4 孔出现凝集，表明每50μL 病毒含有8 个凝集单位（即25μL中含有4 个红细胞凝集），该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第5 孔也出现凝集，说明每50μL 病毒含有16 个凝集单位，该抗原必须等量稀释。如只有前3 孔凝集，表明每50μL 病毒仅含有4 个凝集单位，病毒量需要加倍。此外，4 个凝集单位抗原必须每次用前新配制。
4．红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体
将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1 称为第一列；平行方向称行，如A1～A12 称为A 行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。
（1）每孔加入25μL PBS。
（2）A1 加入25μL 标准诊断血清作为阳性对照；A2 加入25μL H5N1 阴性血清作为阴性对照。
（3）自A3 孔开始分别加入25μL 待检血清；
（4）用多道加样器吸取25μL 血清（A1-A12），由A 行至H 行做2 倍系列稀释血清，至H 行后弃去25μL。系列稀释时需注意每一次稀释都应混合均匀。
（5）加入25μL 含4 个凝集单位的抗原。
（6）混匀后室温孵育30min。
（7）每孔加入50μL 1%马红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。
（8）室温孵育45-60min，观察红细胞凝集抑制试验结果。
（9）结果判定
当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。如1：80 稀释的血清孔不出现凝剂（红细胞凝集完全抑制），1：160 稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。人血清对H5N1 抗原的抑制效价≥1：160 可判定为阳性（参考WHO 推荐标准），但还需要用另一种血清学方法验证。
二、流感/禽流感单放射免疫扩散溶血技术抗体检测
（一）生物安全要求
抗原的制备和血清灭活根据所从事病毒的种类在相应的生物安全级别实验室进行，SRH 检测在生物安全二级（BSL-2）实验室进行操作。
（二）材料
1．Alsever’s 液
2．pH 7.2 PBS 缓冲液
3．10%叠氮钠（sodium azide， NaN
3）溶液
4．5×10-4mol/L KIO
4（过碘酸钾）溶液11.5 mg KIO
4 加入pH7.2 PBS 溶液至100mL，完全溶解后置4℃保存。
5．1%琼脂糖
6．1%鸡红细胞悬液
7．浓鸡红细胞（洗涤后去掉上清的鸡红细胞）
8．补体的制备
至少6 只健康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午从心脏采血，每只可采5～10mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混匀后使用，当天分离血清，分装，置-70℃冰箱中保存。由于补体耐热性差，因此，操作时尽量在4℃条件下进行。
9．抗原
一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，甲醛灭活的病毒需在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。
10．参比血清
抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒参比兔血清。
11．测定血清
血清检测前56℃ 30min灭活去除血清中不耐热的非特异性抑制素和补体；血清从56℃水浴箱中取出，置室温冷却，每管加终浓度为20%的浓鸡红细胞，混匀，置室温1h 或4℃过夜，1500rpm 离心10min，弃沉淀物，留上清。红细胞吸附的目的是去除人血清中可能含有对鸡红细胞的嗜异性抗体（Forssman’santibody）。
12．免疫扩散板
13．打孔器，孔径为2mm 和3mm 的打孔器。
14．小烧杯，带盖的可装扩散板的塑料盒。
15．测量放大镜（带有每个刻度0.1mm 的刻度尺）或一般透明并带刻度的尺子。根据测量的溶血圈直径，可按下列公式计算出溶血圈面积（S）：S1＝πR12 S2＝πR22 S＝S1-S2
如用3mm孔径，测量的溶血圈直径为8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面积：S1＝πR1
2 ＝ π×42＝3.1416×16＝50.27（mm
2）S2＝πR22＝π×1.52＝3.1416×2.25＝ 7.07（mm
2）S＝S1-S2＝50.27-7.07＝43.20 （mm
2）
（三）实验步骤
1、病毒抗原红细胞凝集滴度的测定及1000 个红细胞凝集单位计算
（1）病毒抗原红细胞凝集滴度的测定采用鸡血球，按常规流感病毒96 孔微孔板进行病毒滴度测定。
（2）1000 个红细胞凝集单位计算根据红细胞凝集滴度算出1000 个红细胞凝集单位所需测定病毒的量。如病毒滴定时红细胞凝集滴度为64，则按下列公式计算：0.05：64＝x：1000， x ＝（0.05×1000）/64＝50/64＝0.78（mL）也就是说，每0.1mL浓的鸡红细胞中需要加入0.78mL测定的病毒溶液。按这个比例算出实验所需的病毒量。
2．溶解1%琼脂糖并恒温于60℃水浴箱中。
使用PH7.2 的PBS 同时加入1‰NaN
3 以防止细菌生长。煮沸或者用微波炉使1%琼脂糖完全溶解，速置60℃水浴箱中，分装于小烧杯中，2.9mL/杯，置60℃水浴箱中。根据工作量计算出所需烧杯的数量。
3．红细胞处理
按每块扩散板需50μl 浓的鸡红细胞，计算出工作中所需的浓红细胞容量，将所需的浓鸡红细胞放入带尖底的15mL离心管中，加入等容量的5×10
-4 mol/LKIO
4，混匀，置室温15min。 KIO
4处理的目的是使病毒吸附到红细胞表面后不会游离下来。
4．加病毒抗原
按每0.1mL 浓鸡红细胞需1000个红细胞凝集单位病毒抗原的比例，加入KIO
4处理过的红细胞，混之，置室温10min，1500rpm离心3min，弃上清，用至少5倍量于沉淀物的pH7.2 PBS冲洗，1500rpm离心10min，弃上清，加入与红细胞等量的pH7.2 的PBS。
5．把所需的扩散板平排好，并标明标记。
6．溶血板制备
用吸管将步骤中红细胞轻轻吹匀，而后吸出100μL放入恒温在60℃水浴箱中含2.9mL琼脂糖的烧杯，置水浴中摇匀，而后迅速倒入扩散板中，并迅速用烧杯铺平之。待第一块板铺完后，按同法铺第二块板，直至全铺完。溶血板凝固后应为红细胞均匀分布的透明凝胶板，若出现芝麻样颗粒、浓淡不均的血丝等，均应重新进行铺板。
7．打孔
待琼脂糖完全凝固（一般置室温15～20min）后打孔，诊断用打3mm直径孔，血清流行病学调查打2mm直径孔。打完后用针头将孔中琼脂挑出，然后盖上板盖。
8．加样
孔径3mm的一般10μL/孔，孔径2mm的为4～5μL/孔，每批实验必须要有阳性和阴性血清对照；配对血清应在同一板上进行，以便减少板间的误差。
9．扩散
当每块板加完样本，马上盖上板盖。待全部板加完样本并盖上板盖，平放在带有湿度的盒子中，置4℃冰箱扩散16～18h。
10．加补体
补体从-70℃冰箱取出，用自来水龙头冲之，让其速溶。溶后速置冰上，用冷的pH 7.2 PBS进行1：3或1：4稀释，即1mL补体稀释成3mL或4mL。将扩散板从冰箱取出，平放实验桌上，每板平铺稀释好的补体1mL，平放带有湿度的盒中，无需板盖，平放35～37℃孵箱4h。正常红细胞对照板，除病毒用pH7.2 PBS替代外，其余操作步骤完全与实验板相同。
