7.2 其他核酸抽提方法
甲型H1N1（2009）流感病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取试剂及方法：如采用自动化核酸抽提议和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。
8 实时荧光RT-PCR检测
8.1 反应体系配制
在PCR溶液配制区，参照各试剂盒说明书进行配制 ，每份检测样品的实时荧光 RT-PCR体系为25μL（附录B以AgPath-IDTM One-Step RT-PCR 试剂盒为例，列出反应体系配制表，仅供参考）将 配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。
8.2 扩增检测
8.2.1 加样
在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5μL，盖上管盖，混匀后瞬时离心，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。
8.2.2 PCR扩增检测（扩增检测区）
8.2.2.1 反应条件设定
①反转录45℃ 30min；
②热启动95℃ 10min（不同的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书进行）；
③95℃ 15s，60℃ 45s，40个循环，60℃时设置采集荧光。
8.2.2.2 通道选择
报告荧光（ Report Dye）设定为FAM（或按探针实际标记的荧光基团设定），淬灭荧光（Quench Dye）设定为None，校准荧光（Reference dye）设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。
9 分析条件设定和结果判定
9.1 阈值设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline）以仪器给出的默认值作为参考，阈值（Threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。
9.2 质控
阴性对照和空白对照应无Ct值并无典型扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤30，且呈现典型扩增曲线，有明显的对数增长期（典型扩增曲线的图例见附录C），才可判定试验成立，否则试验无效。
9.3 荧光PCR结果分析及判定
9.3.1 阳性反应结果判定
在试验成立的条件下，检测结果呈现Ct值≤35且呈现典型扩增曲线，判为荧光PCR阳性反应，表明pH1N1（2009）毒株核酸阳性。
