※选项：参照传染病报告卡。
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
采集人员： 采集单位（盖章）：
附表2：疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单
姓名
| 性别
| 年龄
| 职业※
| 现住址
| 发病日期
| 标本#
种类
| 标本量*
（g或ml）
| 采集
日期
| 备注
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※选项：参照传染病报告卡
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。
填表人员： 送样时间： 单位（盖章）：
附件3：
real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程
中文翻译版（请同时参考英文原版）
请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。
美国CDC实时RTPCR（rRTPCR）检测猪流感操作规程（2009版）
本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概 述
（一）前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）实验原理
实时荧光定量RTPCR（rRTPCR）法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
（三）使用条件
一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
（四）生物安全要求
样本处理应在相应的生物安全实验室完成。
（五）样本要求
1、呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准
1）未在2－4°C （≤4 天）或-70°C及以下保存的样本
2）以上未列的其它不当样本
（六）核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒 （QIAGEN公司），罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒， MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II， 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。
（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。
二、实验材料
（一）试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2、分子级无菌蒸馏水 （无RNA酶和DNA酶）；
3、正反向引物 （40μM）；
4、双重标记探针（10μM）；
5、阳性对照。
（二）供给
1、实验室标记笔；
2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；
3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；
4、0.2ml PCR 反应管盘；
5、光学反应盖板；
6、无菌，无核酸酶的1.5 ml微量离心管；
7、一次性无粉手套。
（三）仪器设备
1. 微量离心机；
2. 漩涡振荡器；
3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。
三、操作程序
（一）准备工作
1. 避免样品污染
由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：
1）实验准备与核酸提取使用独立区域；
2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；
3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；
4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；
5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
