3．2 病料应放在含有抗生素的pH值7．0～7．4的等渗PBS内（无PBS可用25％～50％的甘油盐水）。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2000IU／mL）、链霉素（2mg／mL）、丁胺卡那霉素（1 000 IU ／mL）和制霉菌素（1000IU／mL），但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍，加入抗生素后pH值应调至7．0～7．4。
3．3 在室温放置1～2h后样品应尽快处理，可在4℃存放几天，也可于低温条件下保存（-70℃贮存最好）。
3．4 处理时将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子；粪便、研碎的组织用含抗生素的pH值 7．0～7．4 的等渗PBS 溶液配成10％～20％（W／V）的悬液。样品液经1 000r／min离心10min，取上清液作为接种材料。
4 诊断指标
4．1 临床诊断指标
4．1．1 急性发病死亡；
4．1．2 脚鳞出血；
4．1．3 鸡冠出血或发绀、头部和脸部水肿；
4．1．4 鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻症状，有时可见角膜炎症，甚至失明。
4．2 病理诊断指标
4．2．1 肌肉和其他组织器官广泛性严重出血；
4．2．2 消化道、呼吸道粘膜广泛充血、出血；腺胃粘液增多，可见腺胃乳头出血、腺胃和肌胃之间交界处粘膜可见带状出血；
4．2．3 输卵管的中部可见乳白色分泌物或凝块；卵泡充血、出血、萎缩、破裂，有的可见“卵黄性腹膜炎”；
4．2．4 脑部出现坏死灶、血管周围淋巴细胞管套、神经胶质灶、血管增生等病变；胰腺和心肌组织局灶性坏死。
4．3 血清学诊断指标
4．3．1 H5或H7的血凝抑制（HI）效价达到2（4 上标）及以上；
4．3．2 禽流感琼脂免疫扩散试验（AGID）阳性（水禽除外）；
4．3．3 禽流感酶联免疫吸附试验（ELISA）阳性。
4．4 病原学诊断指标
4．4．1 H5或H7亚型病毒分离阳性，病毒在缺乏胰蛋白酶的敏感细胞上能够生长，并产生明显的细胞病变（CPE），对血凝素基因裂解位点的氨基酸序列测定结果与高致病性禽流感分离株基因序列相符；
4．4．2 特异性高致病性禽流感分子生物学方法试验诊断阳性；
4．4．3 静脉内接种致病指数（IVPI）大于1．2。
4．5 结果判定
4．5．1 临床怀疑为高致病性禽流感
符合临床诊断指标4．1．1，且至少有临床诊断指标4．1．2、4．1．3、4．1．4之一的，或至少有病理诊断指标4．2．1、4．2．2、4．2．3、4．2．4之一的。
4．5．2 疑似高致病性禽流感
非免疫禽符合结果判定4．5．1，且符合血清学诊断指标4．3．1、4．3．2或／和4．3．3 之一的；免疫禽符合结果判定4．5．1，且能排除鸡新城疫和中毒性疾病的。
4．5．3 确诊
符合结果判定4．5．2，且至少符合病原学诊断指标4．4．1、4．4．2、4．4．3 之一的；或符合结果判定4．5．1，且符合4．4．1、4．4．2、4．4．3之一的。
5 实验室诊断方法
5．1 病原鉴定方法
5．1．1 通过鸡胚接种进行病原分离 粪便和组织悬液经1000r／min离心10min，上清液以0．2mL／胚的剂量经尿囊腔途径接种9～11日龄SPF 鸡胚，每个样品接种5个胚，于37℃孵化箱内孵育4～5d。接种18h后每8h观察鸡胚死亡情况，死亡鸡胚或者濒死鸡胚以及孵育末期所有的鸡胚放在4℃冷却，检测尿囊液的HA 活力（见5．4）。阳性反应说明可能有正粘病毒科的流感病毒，阴性反应的尿囊液至少应再传2代。
5．1．2 用AGID试验（见5．3）检测，可证明是否存在A型流感病毒属所有成员共同存在的核衣壳和基质抗原。
5．1．3 抗原制备方法
5．1．3．1 用含毒鸡胚尿囊液制备。将含毒尿囊液超速离心或者在酸性条件下进行沉淀以浓缩病毒。
酸性沉淀法是将1．0mol／L HCl加入到含毒尿囊液中，调pH值到4．0，将混合物置于冰浴中作用1h，经1000r／min，4℃离心10min，弃去上清液。病毒沉淀物悬于甘氨-肌氨酸缓冲液中（含1％十二烷酰肌氨酸缓冲液，用0．5mol／L 甘氨酸调pH值至9．0）。沉淀物中含有核衣壳和基质多肽。
5．1．3．2 用鸡胚绒毛尿囊膜制备。从尿囊液呈HA 阳性的感染鸡胚中取绒毛尿囊膜，将其匀浆或研碎，然后反复冻融三次，经1000r／min离心10min，弃沉淀，取上清液用0．1％福尔马林灭活24h，制备抗原。
5．2 静脉致病指数（IVPI）试验方法
收获接种病毒的SPF 鸡胚的感染性尿囊液，测定其血凝价大于1：16（2（4 上标）或lg2（4 上标）），将含毒尿囊液用灭菌生理盐水稀释10倍（切忌使用抗生素），将此稀释病毒液以0．1mL／羽静脉接种10只6周龄SPF鸡，2只同样鸡只接种0．1mL稀释液作对照（对照鸡不应发病，也不计入试验鸡）。每隔24小时检查鸡群一次，共观察10天。根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡记为0，病鸡记为1，重病鸡记为2，死鸡记为3（病鸡和重病鸡的判断主要依据临床症状表现。一般而言，“病鸡”表现有下述一种症状，而“重病鸡”则表现下述多个症状，如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和／或肉髯发绀、脸和／或头部肿胀、神经症状。死亡鸡在其死后的每次观察都记为3）。
IVPI值＝每只鸡在10d内所有数字之和／（10只鸡×10d），如指数为3．00，说明所有鸡24h内死亡；指数为0．00，说明10d观察期内没有鸡表现临床症状。
当IVPI值大于1．2 时，判定分离株为高致病力禽流感病毒（HPAIV）。
5．3 琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）
因为A型流感病毒都有抗原性相似的核衣壳和基质抗原，可以利用免疫扩散试验检测A型流感病毒的存在与否。琼脂免疫扩散试验已作为常规试验方法来检测鸡与火鸡的特异性抗体，并可作为鸡群感染证据。
5．3．1 琼脂板制备
该试验常用1克优质琼脂粉或0．8～1g琼脂糖加入100mL0．01mol／L pH值7．2的8％氯化钠-磷酸缓冲液中，水浴加热融化，稍凉（60～65℃），倒入琼脂板内（厚度为3mm），待琼脂凝固后，4℃冰箱保存备用。用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3mm～4mm，孔距为3mm。
5．3．2 加样
用移液器滴加抗原于中间孔，周围1、4孔加阳性对照血清，其余孔加被检血清，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头，并设阴性对照血清。
5．3．3 孵育
将琼脂板加盖保湿，倒置于37℃温箱，24～48h后，判定结果。
5．3．4 结果判定
当标准阳性血清与标准抗原孔之间有明显沉淀线时，试验成立。
5．3．4．1 阳性：被检血清与抗原孔之间形成沉淀线，并与阳性对照血清的沉淀线末端吻合。
5．3．4．2 弱阳性：被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯（需重复试验）。
5．3．4．3 阴性：被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，且阳性血清沉淀线指向被检血清孔。
5．4 血凝抑制（HI）试验
5．4．1 操作程序
5．4．1．1 抗原血凝效价测定
（1）10％和1％ 鸡红细胞液的制备
① 采血：用注射器吸取阿氏液约1mL，取SPF鸡（最少2只），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。
② 洗涤鸡红细胞：将离心管中的血液经1500～1800r／min离心5min，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800r／min离心5min，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再多次重复以上过程后，加入阿氏液5～10mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5d。
③ 10％鸡红细胞悬液：取阿氏液保存不超过5d的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r／min5min，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积（mL），加入9倍体积（mL）的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。
④ 1％鸡红细胞液：取混合均匀的10％鸡红细胞悬液1mL，加入9mL生理盐水，混合均匀即可。
（2）抗原血凝效价测定（HA 试验，微量法）
① 在微量反应板的1孔～12孔均加入0．025mLPBS，换滴头。
② 吸取0．025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第1孔，混匀。
③ 从第1孔吸取0．025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0．025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0．025mL弃之，换滴头。
④ 每孔再加入0．025mLPBS。
⑤ 每孔均加入0．025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录B。
⑥ 振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1h）。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。
⑦ 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。
5．4．1．2 血凝抑制（HI）试验（微量法）
（1）根据5．4．1．1 试验结果配制4HAU 的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4 即为含4HAU 的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU 抗原的稀释倍数应是1：64（256除以4）。
（2）在微量反应板的1孔～11孔加入0．025mLPBS，第12孔加入0．05mLPBS。
（3）吸取0．025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0．025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0．025mL弃去。
（4）1孔～11孔均加入含4HAU 混匀的病毒抗原液0．025mL，室温（约20℃）静置至少30min。
（5）每孔加入0．025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高，可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。
（6）结果判定
以完全抑制4个HAU 抗原的血清最高稀释度作为HI 滴度。
只有阴性对照血清滴度不大于1／4（以倒数标识大于2（2 上标）或2log2），阳性对照误差不超过1个滴度，试验才有效。
血清稀释度大于或等于1／16（2（4 上标）或4log2）能抑制4HAU 抗原，可判为抗体阳性，使用8HAU 抗原时，阳性滴度为大于等于1／8（2（3 上标）或3log2）
5．5 禽流感RT-PCR 试验
5．5．1 试剂／引物
5．5．1．1 变性液：见附录A．1
5．5．1．2 2M醋酸钠溶液（pH4．0）：见附录A．2
5．5．1．3 水饱和酚（pH4．0）
5．5．1．4 氯仿／异戊醇混合液：见附录A．3
5．5．1．5 M-MLV 反转录酶（200u／μL）
5．5．1．6 RNA 酶抑制剂（40u／μL）
5．5．1．7 Taq DNA 聚合酶（5u／μL）
5．5．1．8 1．0％ 琼脂糖凝胶：见附录A．4
5．5．1．9 50×TAE 缓冲液：见附录A．5
5．5．1．10 溴化乙锭（10μg／μL）：见附录A．6
5．5．1．11 加样缓冲液：见附录A．7
5．5．1．12 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水：见附录A．8
5．5．1．13 5×反转录反应缓冲液（附录A．9）
5．5．1．14 2．5mmol dNTPs（附录A．10）
5．5．1．15 10×PCR Buffer（附录A．11）
5．5．1．16 DNA 分子量标准
5．5．1．17 引物：见附录B
5．5．2 操作程序
5．5．2．1 样品的采集和处理：按照GB／T 18936中提供方法进行。
5．5．2．2 RNA 的提取
（1）设立阳性、阴性样品对照。
（2）异硫氰酸胍一步法
① 将组织或细胞中加入适量的变性液，匀浆。
② 将混合物移至一管中，按每毫升变性液中立即加入0．1mL乙酸钠，1mL酚，0．2mL氯仿-异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。
③ 将匀浆剧烈振荡10s。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。
④ 12000r／min，4℃离心20min，将上层含RNA 的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA 污染的可能性，不要吸取水相的最下层。
⑤ 加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，并在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。
⑥ 4℃ 12000 r／min离心10 min，弃上清，用75％的乙醇洗涤沉淀，离心，用吸头彻底吸弃上清，自然条件下干燥沉淀，溶于适量DEPC 处理的水中。-20℃贮存，备用。
（3）也可选择市售商品化RNA 提取试剂盒，完成RNA 的提取。
5．5．2．3 反转录
（1）取5μLRNA，加1μL反转录引物，70℃作用5min。
（2）冰浴2min。
（3）继续加入：
5×反转录反应缓冲液 4μL
0．1MDTT 2μL
2．5mmol dNTPs 2μL
M-MLV 反转录酶 0．5μL
RNA 酶抑制剂 0．5μL
DEPC 水 11μL
37℃水浴1h，合成cDNA链。取出后可直接进行PCR，或者放于-20℃保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。
5．5．2．4 PCR
根据扩增目的不同，选择不同的上／下游引物，M-229U／M-229L是型特异性引物，用于扩增禽流感病毒的M基因片段；H5-380U／H5-380L、H7-501U／H7-501L、H9-732U／H9-732L分别特异性扩增H5、H7、H9 亚型血凝素基因片段；N1-358U／N1-358L、N2-377U／N2-377L分别特异性扩增N1、N2 亚型神经氨酸酶基因片段。
PCR 为50μL 体系，包括：
双蒸灭菌水 37．5μL
反转录产物 4μL
上游引物 0．5μL
下游引物 0．5μL
10×PCR Buffer 5μL
2．5mmol dNTPs 2μL
Taq 酶 0．5μL
首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入1 滴液体石蜡（约20μL）。循环参数为95℃5min，94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 45s，循环30次，72℃延伸6min结束。设立阳性对照和阴性对照。
5．5．2．5 电泳
（1）制备1．0％琼脂糖凝胶板，见附录A．4。
（2）取5μL PCR 产物与0．5μL 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。
（3）加入分子量标准。
（4）盖好电泳仪，插好电极，5V／cm电压电泳，30～40min。
（5）用紫外凝胶成像仪观察、扫描图片存档，打印。
（6）用分子量标准比较判断PCR 片段大小。
5．5．3 结果判定
5．5．3．1 在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带时判定结果。
5．5．3．2 用M-229U／M-229L检测，出现大小为229bp 扩增片段时，判定为禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
5．5．3．3 用H5-380U／H5-380L检测，出现大小为380bp扩增片段时，判定为H5 血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
5．5．3．4 用H7-501U／H7-501L检测，出现大小为501bp扩增片段时，判定为H7 血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
5．5．3．5 用H9-732U／H9-732L检测，出现大小为732bp扩增片段时，判定为H9 血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
5．5．3．6 用N1-358U／N1-358L检测，出现大小为358bp扩增片段时，判定为N1 神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
5．5．3．7 用N2-377U／N2-377L检测，出现大小为377bp扩增片段时，判定为N2 神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
5．6 禽流感病毒（NASBA）检测
5．6．1 材料准备
5．6．1．1 试验环境
洁净分区环境，分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。
5．6．1．2 器材
采用常规的分子生物学器材，包括：一次性手套、移液器（量程5μ到200μL）、滴头、无RNA酶的1．5mL塑料离心管、1．5mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计（精度±2°C）、加热器、水浴锅、5mL聚丙烯试管（VWR）、封口膜。
如果采用ECL方法，需要NucliSens阅读器或者其它等同仪器。
如果采用ELISA方法，需要酶标仪。
5．6．1．3 引物
上游引物 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAG G A（A／G）G GCA TT（C／T） TGG ACA AA（G／T） CGT CTA
下游引物 GAT GCA AGG TCG CAT ATG AGG AGA GAA GAA GAA AAA AGA GAG GAC
5．6．1．4 检测试剂：所有检测试剂在使用前，使其达到室温。
（1）裂解缓冲液（5mol／L异硫氰酸胍，10％Triton X-100，10mmol／LTris／HCl）；
（2）冲洗缓冲液（5mol／L异硫氰酸胍，10mmol／LTris／HCl）；
（3）500mg／mL硅土（500mg／mL盐酸活化的二氧化硅。
（4）洗脱缓冲液（10mmol／LTris／HCl）；
（5）酶溶液（见附录C）；
（6）H5 捕捉探针（10mmol／L 生物素化寡聚核苷酸）；
探针序列为 Biotin-CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA
（7）电化学发光法属别检测探针（钌标记的DNA 寡聚核苷酸）；
ECL 序列为 GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TA
（8）仪器调试参照液；
（9）检测稀释液（15mmol／LTris-／HCl）；
（10）分析缓冲液；（50mmol／LTris-HCl）；
（11）清洗液（100mmol／L KOH，10％SDS，10％ Triton X-100）；
（12）无水乙醇。
5．6．1．5 样品采集、保存、处理按GB／T 18936－2003中2．1款进行。
5．6．2 操作方法
5．6．2．1 核酸释放和提取
（1）将0．1mL样品加入盛有0．9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合；
（2）振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加入50μL；
（3）振荡混合均匀；
（4）室温下温育10min（每2min振荡混合一次，防止硅土沉淀）；
（5）在12，000r／min下离心裂解缓冲液管30s；
（6）小心移除上清液（不要搅动沉淀）后，向每个管中加入1mL冲洗缓冲液；
（7）振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止；
（8）在12000r／min下离心30s，然后移除上清液；
（9）重复第（6）到第（8）的步骤。第一次使用冲洗缓冲液；第两次使用70％乙醇；最
后一次使用无水乙醇；
（10）最后一次洗涤步骤后，用移液器小心移除残余乙醇；
（11）使用加热器在56℃敞口干燥硅土10min（用薄纸覆盖每个管避免污染）；
（12）干燥后向每个管加入50μL 洗脱缓冲液；
（13）振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮；
（14）56℃温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸（5min后开始振荡试管）；
（15）在12000r／min下离心2min；
（16）将5μL 核酸上清液转移至新试管，在1h内开始扩增反应。
以上步骤也可采用Qiagen 试剂盒或者其它等同试剂盒进行。
5．6．2．2 核酸扩增
（1）在向上述5μL核酸（5．1 p）中加入10μL扩增试剂；
（2）65℃温育5min；
（3）41℃温育5min；
（4）加入5μL酶溶液，并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀；
（5）放回试管，并继续在41℃温育5min；
（6）将试管稍作离心后，在41℃温育90min；
（7）检测扩增产物；
（8）在-70℃下保存扩增产物不超过30d。
5．6．2．3 核酸检测
按照以下步骤或用ELISA方法进行检测。
（1）将（N*＋2）个5mL聚丙烯试管进行编号，试管1作为空白对照；
（2）振荡混合，除了试管1外，其余试管各加入20μL杂交溶液（见附录D）；
（3）试管2中加入5μL检测稀释液作为空白对照；
（4）其余试管各加5μLRNA扩增产物；
（5）封口膜封住所有试管，振荡混合；
（6）所有试管41℃温育30min。每10min混合一次；
（7）除了试管1外，其余试管各加入0．3mL分析缓冲液；
（8）振荡仪器调试参照液直至不透明，然后加0．25mLIRS到试管1。
（9）把试管放在转盘式传送盘的适当位置上。
（10）运行NucliSens阅读器，对数据进行分析和解释（见附录E）。
*注：N为样品数。
5．6．3 结果判定
通过大量分析已知阴性对照样品后，确定NASBA／ECL的临界值为0．15X仪器参照溶液的数值。样品的读数超过临界值时，判为禽流感病毒阳性，低于临界值时，判为禽流感病毒阴性。
5．7 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测
5．7．1 材料与试剂
5．7．1．1 仪器与器材
荧光RT-PCR检测仪
高速台式冷冻离心机（离心速度12000r／min以上）
台式离心机（离心速度3000r／min）
混匀器
冰箱（2～8℃和-20℃两种）
微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头离心管（1．5mL）。
5．7．1．2 试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。
氯仿；
异丙醇：-20℃ 预冷；
PBS：121±2℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 U／mL；75％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB6682要求）配制，-20℃预冷；
禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项见附录B
5．7．2 抽样
5．7．2．1 采样工具
下列采样工具必须经（121±2）℃，15min高压灭菌并烘干：
棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1．5mL离心管、研钵。
5．7．2．2 样品采集
（1）活禽
取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3-5次取咽喉分泌液；
取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；
将拭子一并放入盛有1．0mLPBS的1．5mL离心管中，加盖、编号。
（2）肌肉或组织脏器
待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号，送实验室。
（3）血清、血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌采样管中，编号备用。
5．7．2．3 样品贮运
样品采集后，放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。
5．7．2．4 样品制备
（1）咽喉、泄殖腔拭子
样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。
（2）肌肉或组织脏器
取待检样品2．0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃，3000r／min离心15min，取上清液转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。
5．7．2．5 样本存放
制备的样本在2～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。
5．7．3 操作方法
5．7．3．1 实验室标准化设置与管理
禽流感病毒通用荧光RT－PCR检测的实验室规范。
5．7．3．2 样本的处理
在样本制备区进行。
（1）取n个灭菌的1．5mL离心管，其中n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），编号。
（2）每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头，再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4℃、12000r／min离心15min。
（3）取与⑴相同数量灭菌的1．5mL离心管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸取本标准⑵各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混匀。
（4）于4℃、12 000r／min离心15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75％乙醇，颠倒洗涤。
（5）于4 ℃、12 000 r／min离心10min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。
（6）4000 r／min离心10s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3 min，不能过于干燥，以免RNA 不溶。
（7）加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2 000r／min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PC扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。
5．7．3．3 检测
（1）扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r／min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制如下：RT-PCR反应液15μL，Taq酶0．25μL。根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积中，向其中加入0．25×n颗RT-PCR反转录酶颗粒，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。
（2）加样
在样本处理区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理中制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，500r／min离心30s。
（3）荧光RT-PCR检测
在检测区进行。将本标准中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：第一阶段，反转录42℃／30min；第二阶段，预变性92℃／3min；第三阶段，92℃／10s，45℃／30s，72℃／1min，5个循环；第四阶段，92℃／10s，60℃／30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
5．7．4 结果判定
5．7．4．1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
5．7．4．2 质控标准
（1）阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
（2）阳性对照的Ct值应＜28．0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
5．7．4．3 结果描述及判定
（1）阴性
无Cut值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒。
（2）阳性
Cut值≤30．0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在禽流感病毒。
（3）有效原则
Ct值＞30．0的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。
附录A
（规范性附录）
相关试剂的配制
A．1 变性液
4M异硫氰酸胍
25mM柠檬酸钠
0．5％（m／V）十二烷基肌酸钠
0．1Mβ-巯基乙醇
具体配制：将250g 异硫氰酸胍、0．75mol／L（pH7．0）柠檬酸钠17．6mL和26．4mL10％（m／V）十二烷基肌酸钠溶于293mL水中。65℃条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次临用前按每50mL变性液加入14．4 mol／L 的β-巯基乙醇0．36mL的剂量加入。变性液可在室温下避光保存数月。
A．2 2mol／L 醋酸钠溶液（pH4．0）
乙酸钠 16．4g
冰乙酸 调pH至4．0
灭菌双蒸水 加至100mL
A．3 氯仿／异戊醇混合液
氯仿 49mL
异戊醇 1mL
A．4 1．0％琼脂糖凝胶的配制
琼脂糖 1．0g
0．5×TAE 电泳缓冲液 加至100mL
微波炉中完全融化，待冷至50-60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。
A．5 50×TAE 电泳缓冲液
A．5．1 0．5mol／L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液 （pH8．0）
二水乙二铵四乙酸二钠 18．61g
灭菌双蒸水 80mL
氢氧化钠 调pH至8．0
灭菌双蒸水 加至100mL
A．5．2 TAE 电泳缓冲液（50×）配制
羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242g
冰乙酸 57．1mL
0．5mol／L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8．0） 100mL
灭菌双蒸水 加至1000mL
用时用灭菌双蒸水稀释使用。
A．6 溴化乙锭（EB）溶液
溴化乙锭 20mg
灭菌双蒸水 加至20mL
A．7 10×加样缓冲液
聚蔗糖 25g
灭菌双蒸水 100mL
溴酚蓝 0．1g
二甲苯青 0．1g
A．8 DEPC 水
超纯水 100mL
焦碳酸二乙酯（DEPC） 50μL
室温过夜，121℃高压15min，分装到1．5mLDEPC处理过的微量管中。
A．9 M-MLV 反转录酶5×反应缓冲液
1moL Tris-HCl （pH8．3） 5mL
KCl 0．559g
MgCl（2 下标） 0．029g
DTT 0．154g
灭菌双蒸水 加至100mL
A．10 2．5mmol／LdNTP
DATP（10mmol／L） 20μL
DTTP（10mmol／L） 20μL
DGTP（10mmol／L） 20μL
DCTP（10mmol／L） 20μL
A．11 10×PCR 缓冲液
1MTris-HCl （pH8．8） 10mL
1MKCl 50mL
Nonidet P40 0．8mL
1．5moL MgCl（2 下标） 1mL
灭菌双蒸水 加至100mL
附录B
（规范性附录）
禽流感病毒RT-PCR 试验用引物
B．1 反转录引物
Uni12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′，引物浓度为20pmol。
B．2 PCR 引物
见下表，引物浓度均为20pmol。
B．2 PCR 过程中选择的引物
┏━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┓
┃引物名称 ┃ 引物序列 ┃长度（bp）┃扩增目的 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃M-229U ┃ 5’-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’ ┃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ 229 ┃ 通用引物 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫ ┃ ┃
┃ M-229L ┃ 5’-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’ ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ H5-380U ┃ 5’-AGTGAATTGGAATATGGTAACTG-3’ ┃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ 380 ┃ H5 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫ ┃ ┃
┃ H5-380L ┃ 5’-AACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT-3’ ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ H7-501U ┃ 5’-AATGCACARGGAGGAGGAACT-3’ ┃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ 50l ┃ H7 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫ ┃ ┃
┃ H7-501L ┃ 5’-TGAYGCCCCGAAGCTAAACCA-3’ ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ H9-732U ┃ 5’-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3’ ┃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ 732 ┃ H9 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫ ┃ ┃
┃ H9-732L ┃ 5’-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3’ ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ N1-358U ┃ 5’-ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC-3’ ┃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ 358 ┃ N1 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫ ┃ ┃
┃ N1-358L ┃ 5’-GTCWCCGAAAACYCCACTGCA-3’ ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃N2-377U ┃ 5’-GTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG-3’ ┃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ 377 ┃ N2 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫ ┃ ┃
┃ N2-377L ┃ 5’-GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA-3’ ┃ ┃ ┃
┗━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┛
W＝（AT）；Y＝ （CT）；R ＝（AG）。
附录C
（规范性附录）
酶溶液的配制
C．1 配制材料
C．1．1 酶球（单个酶球（6．5mg）含1．3U／μL AMV－RT，0．51．3U／μL RNaseH，151．3U／μL T7RNA 聚合酶，100mmol／LTris ／HCl，10％BSA）；
C．1．2 酶球稀释剂（0．42μg／μL BSA）；
C．1．3 球状骨针（单个球状骨针为10mg，4mmol／LNTP，15mDTT，40mmol／LMgCl2。
C．1．4 球状骨针稀释剂（100mmol／LTris／HCl pH8．3，2mmol／LdNTP）；
C．1．5 氯化钾溶液（100mmol／LKCl solution）；
C．1．6 引物混合物（10mmol／L Primer Mixture）；
C．1．7 阳性对照RNA（positive control RNA）；
C．1．8 DEPC 水。
C．2 配制过程
C．2．1 酶稀释液的制备
C．2．1．1单个球状骨针中加入80μL 球状骨针稀释剂，并迅速振荡均匀；
C．2．1．2 稀释的球状骨针中加入16μL KCl 溶液和14μL DEPC 水，振荡均匀；
C．2．1．3 加入10μL 引物混合物，振荡混合；
C．2．1．4 不能离心；
C．2．1．5 在30min内使用。
C．2．2 酶溶液的制备
C．2．2．1 单个酶球中加入55μL 酶稀释液，将此溶液放置室温至少20min；
C．2．2．2 用手指轻轻扣击试管让酶球充分溶解；
C．2．2．3 不能剧烈振荡任何含酶的溶液；
C．2．2．4 使用前，稍作离心；
C．2．2．5 在60min内使用。
附录D
（规范性附录）
杂交溶液的配制
杂交溶液制备
D．1 振荡通用型捕捉探针和ECL探针直到形成不透明溶液。
D．2 对于N次特异性检测反应，在新试管中混合（N＋2）×10μL捕捉探针和（N＋2）×10μL ECL 探针。
D．3 使用前稍作振荡。
D．4 在60min内使用。
附录E
（资料性附录）
NucliSens阅读器的操作运行
E．1 建立一个新的运行程序。
E．1．1 打开NucliSens阅读器的个人电脑。
E．1．2 在开始界面点击“Prime”来执行系统校准。
E．1．3 机器准备好后，点击“Start”。校准步骤大约持续3min。
E．1．4 在登入（log-in）界面的用户名（user name）上选择“service engineer”并且点击“login”。不需要输入密码。
E．1．5 在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“New Run”。
E．1．6 在弹出的工作表界面点击“yes”。
E．1．7 输入文件名（不超过8个字符）并且点击“ok”。
E．1．8 一个工作表单会打开，在分析选择栏（selectedassay）选择“Free tube”。
E．1．9 输入样品号并且点击“Addto list”。
E．1．10 重复上述步骤直到输入所有样品ID。
E．1．11 输入所有样品号后，点击“close”键。
E．1．12 屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表。检查工作表，检查无误后点击“OK”。
E．2 确定样品放在转盘式传送盘（instrument carousel）上，并且按照计算机中输入的样品ID顺序摆放。
E．3 在屏幕上方选择“Routine”菜单然后点击“Run Worklist”。
E．4 出现一个检查弹出窗口，点击“Proceed”。
E．5 检测开始（每个试管用时大约1．5min）。
E．6 检测停止后，在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“Sample results”或者“Assay result”显示结果。
附录F
（规范性附录）
磷酸盐缓冲盐水配方
以下所用试剂均为分析纯。
F．1 A液
0．2 mol／L磷酸二氢钠水溶液
NaH（2 下标）PO（4 下标）·H（2 下标）O 27．6g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1000mL。
F．2 B液
0．2mol／L磷酸氢二钠水溶液
Na（2 下标）HPO（4 下标）·7H（2 下标）O 53．6g，（或Na（2 下标）HPO（4 下标）·12H（2 下标）O 71．6g或Na（2 下标）HPO（4 下标）·2H（2 下标）O 35．6 g）加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。
F．3 0．01 mol／L、pH7．2 磷酸盐缓冲盐水的配制
0．2 mol／L A液14mL
0．2 mol／L B液36mL
加NaCl 8．5 g
用蒸馏水稀释至1 000mL
附录G
（资料性附录）
试剂盒的组成
G．1 试剂盒组成
每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：
裂解液 30mL×1盒
DEPC水 1mL×1管
RT-PCR反应液（内含禽流感病毒的引物、探针） 750μL×1管
RT-PCR酶 1颗／管×12管
Taq酶 12μL×1管
阴性对照 1mL×1管
阳性对照（非感染性体外转录RNA）1mL×1管
G．2 说明
G．2．1 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4℃保存。
G．2．2 DEPC水，用1％DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。
G．2．3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。
G．3 功能
试剂盒可用于禽类相关样品（包括肌肉组织、脏器、咽喉拭子、泄殖腔拭子、血清或血浆等）中禽流感病毒的检测。
G．4 使用时的注意事项
G．4．1 在检测过程中，必须严防不同样品间的交叉污染。
G．4．2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。
新城疫诊断技术规范
1 范围
本规范规定了新城疫采样、临床及病理学诊断、实验室检验的方法和技术要求。
本规范适用于鸡和其他禽新城疫（ND）的诊断。
2 临床与病理学诊断
2．1 典型临床症状
发病鸡精神沉郁或无任何症状而死亡；体温升高、食欲减退、精神萎顿、产蛋减少或停止；口腔和鼻腔分泌物增多，嗉囊胀满；鸡冠及髯发绀，呼吸困难、喉部发出“咯咯”声；下痢，粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；部分病鸡还出现神经症状，如偏头转颈，作转圈运动或共济失调。
2．2 典型病理变化
主要病变是全身粘膜和浆膜出血；腺胃粘膜水肿，乳头或乳头间有出血点、溃疡或坏死，小肠、盲肠和直肠粘膜有出血、坏死病变；盲肠扁桃体常见肿大、出血和坏死；气管出血，周围组织水肿；肺瘀血、出血或水肿；心冠脂肪有细小如针尖大的出血点；产蛋母鸡的卵泡和输卵管显著充血、出血；淋巴结肿胀、出血和坏死；脑膜充血或出血。
3 样品采集与处理
无菌采取疑似ND病死鸡的大脑组织、气管、肺、肝、脾，装入灭菌小瓶中，盖好瓶盖并记录清楚（编号、采样时间、鸡群编号及发病的情况），样品立即送实验室处理或于－20℃以下冷冻保存。活禽可采其气管和泄殖腔拭子，将其放入盛有抗生素PBS（抗生素的浓度是青霉素2000单位／mL，链霉素2mg／mL，庆大霉素0．05mg／mL，制菌霉素1000单位／mL；粪便样品要求抗生素浓度提高5倍）的离心管中，样品应尽快处理或于4℃保存，但不超过4天。
取采集样品约1g 放入研磨器中磨碎，加入5mL抗生素PBS 制成1：5（W／V）悬液，并在室温下静置1～2h，然后移入小离心管中，在不超过25℃的室温下，以2000r／min离心15min。上清液用于接种鸡胚。或以灭菌离心管盛装磨碎稀释的检样，置台式离心机中5000r／min离心10min，将上清液移入另一只灭菌离心管中8000r／min离心10min，取上清液进行下一项试验。
4 病原分离与鉴定
4．1 鸡胚接种 用1mL注射器吸取无菌样品上清液接种9～10日龄SPF鸡胚的尿囊腔或绒毛尿囊膜，每份样至少接种5枚鸡胚，每胚0．2mL。接种后在35～37℃继续孵化4～5d，弃去24h内死亡的鸡胚。24h以后死亡的和濒死的以及结束孵化时存活的鸡胚置4℃冰箱，4～24h收集其尿囊液。以澄清无菌尿囊液作血凝试验（HA），测定HA 效价，方法同5．2。HA阴性者，至少用SPF鸡胚再传代两次。
4．2 HA 试验
确定尿囊液是否有血凝性，方法同5．2。
4．3 血凝抑制试验（HI）
确定尿囊液中病毒的血凝性是否能被新城疫病毒特异性抗血清所抑制，即确定尿囊液中的病毒是否为新城疫病毒，方法同7．2。
4．4 1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）测定
取血凝滴度为2（4 上标）以上的新鲜感染鸡胚尿囊液，用灭菌生理盐水稀释10倍，脑内注射出壳后24～40h之内的SPF雏鸡，每份样品接种10只，每只接种0．05mL。并设生理盐水和标准毒株阳性对照。接种鸡隔离饲养，每24h观察一次，连续观察8d，每天观察即应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死亡鸡记作2（死亡鸡在死后每天观察都记作2），ICPI是指每只鸡8d内所有观察计分总数的平均数。
8天累计发病数×1＋8天累计死亡数×2
ICPI＝____________________________________
8天累计观察鸡的总数
结果举例见表1。
表1 ICPI 测定结果判定
┏━━━━━━┳━━━┳━━━┳━━━━┳━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━┓
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 8天累计鸡 ┃ ┃
┃ 临诊症状 ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ┃ 7 ┃ 8 ┃ ┃ 分 值 ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 只数 ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 正常 ┃ 10 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 14 ┃ 14×0=0 ┃
┣━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 发病 ┃ 0 ┃ 6 ┃ 10 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 20 ┃ 20×1=20 ┃
┣━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 死亡 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 6 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 46 ┃ 46×2=92 ┃
┣━━━━━━╋━━━┻━━━┻━━━━┻━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━┫
┃ 总值 ┃ 80 112 ┃
┗━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
ICPI＝112／80＝1．4
4．5 6周龄鸡静脉接种致病指数（IVPI）测定
取HA滴度为2（4 上标）以上的新鲜感染尿囊液，用灭菌生理盐水稀释10倍，翅静脉接种6周龄SPF小鸡，每只0．1mL。每份样品接种10只，并设生理盐水和标准毒株阳性对照，隔离饲养。每24h观察一次，连续观察10d，每天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，瘫痪鸡或有其他神经症状的记作2，死亡鸡记作3（死亡鸡在死后的每天观察都记作3）。IVPI是10d内每次观察每只鸡的记录总数的平均数。
10天累计发病数×1＋10天累计瘫痪数×2＋10天累计死亡数×3
IVPI＝___________________________________________________________
10天累计观察鸡只总数
结果判定举例见表2。
表2 IVPI 测定结果判定
┏━━━━━┳━━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━━┳━━━━━━┓
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 10天累 ┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 计 ┃ ┃
┃临诊症状 ┃1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ┃ 7 ┃ 8 ┃ 9 ┃ 10 ┃ ┃ 分 值 ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 鸡只 ┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 数 ┃ ┃
┣━━━━━╋━━━╋━━╋━━╋━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ 正常 ┃ 10 ┃ 2 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 12 ┃ 12×0=0 ┃
┣━━━━━╋━━━╋━━╋━━╋━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ 发病 ┃ 0 ┃ 4 ┃ 2 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 6 ┃ 6×l=6 ┃
┣━━━━━╋━━━╋━━╋━━╋━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ 瘫痪 ┃ 0 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 0 ┃ 6 ┃ 6×2=12 ┃
┣━━━━━╋━━━╋━━╋━━╋━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ 死亡 ┃ 0 ┃ 2 ┃ 6 ┃ 8 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 10 ┃ 76 ┃ 76×3=228 ┃
┣━━━━━╋━━━┻━━┻━━┻━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━━┻━━━━━━┫
┃ 总值 ┃ 100 246 ┃
┗━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
IVPI＝246／100＝2．46
4．6 鸡胚平均致死时间（MDT）测定
将新鲜感染尿囊液，用灭菌生理盐水稀释成10（-6 上标）-10（-9 上标） 五个不同稀释度，每个稀释度分别接种9～10日龄SPF 鸡胚5只，每只尿囊腔接种0．1mL。已接种的鸡胚置于37℃孵育，剩余的稀释病毒液置于4℃，8h后每个稀释度分别接种另外5只鸡胚，每只0．1mL，于37℃继续孵化，每天早晚观察2次，间隔12h，连续观察7d，每次观察都应记录鸡胚死亡的时间。MDT是指最小致死量引起鸡胚死亡的平均时间。
（X小时死亡胚数×X 小时＋Y 小时死亡胚数×Y 小时＋……）
MDT＝___________________________________________________________
死亡胚总数
4．7 结果判定
4．7．1 ICPI值越大，NDV致病性越强。最强毒力病毒的ICPI接近2．0，而弱毒株毒力的ICPI值为0。
4．7．2 IVPI值越大，NDV致病性越强。最强毒力的病毒的IVPI值可达3．0，弱毒株的IVPI值为0。
4．7．3 MDT 低于60h为强毒型NDV；MDT值在60～90h为中等毒力型NDV；MDT 大于90h为低毒力NDV。
5 NDV的HA试验
5．1 材料与试剂
5．1．1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、吸头、96孔V型血凝反应板。
5．1．2 磷酸缓冲盐水（PBS），配制方法见附录A。
5．1．3 1％鸡红细胞悬液，配制方法见附录A。
5．1．4 标准NDV抗原。
5．2 HA 试验
5．2．1 在96孔V型微量血凝反应板上，自第1孔至第11孔每孔加入25μLPBS。
5．2．2 在第一孔中加入被检病毒液（感染尿囊液）25μL；充分混和后移出25μL至第二孔，依次类推作等量倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL。
5．2．3 设11孔为红细胞对照（阴性对照），不加病毒液，只加入25μLPBS；12孔为标准NDV对照。
5．2．4 上述每孔各加入25μL1％鸡红细胞悬液，立即放在微型振荡器上摇匀，室温（约20℃）静置40min，或4℃60min，待阴性对照孔红细胞全部沉淀后，判定结果。血凝效价高于2（10 上标）时可继续增加稀释孔数。方法示意见表3。
表3 NDV的HA试验程式（单位μl）
┏━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 孔号 ┃1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 2（1 上标） 2（2 上标） 2（3 上标） 2（4 上标） 2（5 上标） 2（6 上标） 2（7 上标） 2（8 上标） 2（9 上标） 2（10 上标） ┃
┃ 稀释倍数 ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ PBS ┃ 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 — ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ 病毒液 ┃ 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25（— 上标） 25 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ 1％鸡红细 ┃ 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 ┃
┃ 胞 ┃ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ 感作 ┃20℃左右 40min，或4℃60min ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ # # # # # # # +++ ++ + — ┃
┃ 结果举例 ┃ ┃
┃ ┃ # ┃
┣━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ 注：1）11孔为红细胞对照；12孔为4单位标准（HAU）NDV抗原对照。 ┃
┃ 2）#为完全凝集，+++ ++ +为不完全凝集，—为不凝集。 ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
