4．2．3 结果判定
4．2．3．1 按以下标准判定红细胞凝集程度：＋＋＋＋ 100％完全凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围；＋＋＋ 75％凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点；＋＋ 50％凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点；＋25％凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉积于孔底；－ 不凝集，红细胞完全沉积于孔底成一圆点。
4．2．3．2 4．2．2．1 的结果判定：稀释液Ⅰ对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集试验方成立。
（1）若只第1排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫A型；若只第2排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫O型；以此类推。若只第5排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为猪水泡病。
（2）致红细胞50％凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。
（3）如出现2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为底）浓度以上者即可判为阳性，其余判为阴性。
4．2．3．3 4．2．2．2 的结果判定：稀释液Ⅱ对照孔不凝集试验方可成立。
（1）若第1排出现2孔以上的凝集（＋＋以上），且第2排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第3、4排不出现凝集判为口蹄疫O型阳性。若第3排出现2孔以上的凝集（＋＋以上），且第4排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第1、2排不出现凝集则判为猪水泡病阳性。
（2）致红细胞50％凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。
4．3 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
4．3．1 样品处理
样品的采集、保存和运送方法见《口蹄疫诊断技术》（GB／T18935-2003）附录A。
样品的处理：在无菌环境中，将采集的动物机体组织（如舌、鼻、蹄水泡皮）置乳钵中，剪碎，加灭菌石英砂研磨。其它机体组织（如淋巴结、扁桃体等）除去包膜和其它结缔组织，选取内部实质部分，置乳钵中，剪碎，加灭菌石英砂研磨。再加0．01mol／L PBS（pH7．6-7．8）或MEM（pH7．6-7．8）制成1：5的悬液。-20℃至-30℃冻融2次，3000r／min离心10min，取上清液提取总RNA。
液体样品，如水泡液和OP液直接用于提取总RNA。
4．3．2 试剂
溶液A：TRIzoL，从组织或细胞中提RNA 试剂。
溶液B：三氯甲烷，分析纯。
溶液C：异丙醇，分析纯。
溶液D：无RNase dH（2 下标）O：每100mL水中加入DEPC（焦碳酸二乙酯）原液0．1mL，于室温下作用数小时，然后高压灭菌使DEPC 失活。
溶液E（One Step RNA PCR 混合液）：
10Ⅹ One Step RNA PCR Buffer 50μL
MgCl（2 下标） 100μL
dNTP 50μL
正链引物 30μL
负链引物 30μL
无RNase dH（2 下标）O 110μL
溶液F（AMV Reverse Transcriptase XL，5u／ ul）： 反转录酶。
溶液G（RNase Inhibitor，40u／ ul）： RNA 酶抑制剂。
溶液H（AMV-OptimizedTaq， 5u／ ul）： Taq DNA聚合酶。
溶液I（阳性对照）： 200μL
50×TAE缓冲液：
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242．0g
冰乙酸 57．1mL
0．5mol／L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8．0） 100．0mL
加双蒸水至 1000mL
1×TAE 缓冲液：
使用前将50×TAE作50倍稀释即可。
电泳加样缓冲液：
溴酚兰 0．25g
甘油 30．0mL
双蒸水 70．0mL
4．3．3 操作程序
4．3．3．1 总RNA萃取
（1） 取500μL组织样品研磨上清液置1．5mL离心管中，加等量（500μL）溶液B，快速振荡数秒，8000r／min，4℃离心5min。细胞毒、水泡液、阳性样品不经此步处理。
（2） 取上清液200μL置1．5mL离心管中，加入1000μL溶液A，反复混匀，冰上放置5min。取阳性对照样品（50-200μ均可），同时提RNA。
（3） 加200μL溶液B，小心盖上帽盖，用力摇动离心管15秒，室温放置5min。
（4） 11000r／min，4℃离心15min，可见分为三层，上层水相含RNA。
（5） 转移水相至一新离心管，加入等量溶液C（约500μL），混匀，室温放置15min。
（6） 11000r／min，4℃离心10min，离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA 沉淀。
（7） 洗RNA：弃上清，加1000μ 75％乙醇（使用前用溶液D加无水乙醇配置而成）漂洗沉淀，漂洗二次，10000r／min，4℃离心5min。
（8）室温充分干燥RNA 沉淀。加10μL溶液D，即可用于PCR 扩增。可以-20℃保存备用。
（9） 阳性对照样品：将阳性对照与检验样品同时提取RNA，同样条件下扩增。
4．3．3．2 一步法RT-PCR
（1） 反应总体积25μL。向RNA管中加入下列反应物：
RNA PCR 混合液： 18．5μL
AMV 反转录酶（溶液F）： 0．5μL
RNase 抑制剂（溶液G）： 0．5μL
AMV-OptimizedTaq（溶液H）： 0．5μL
RNA： 5μL
空白对照：以RNase Free dH（2 下标）O 代替模板，同样条件下扩增。
（2） 高速离心10s 后，将反应管放入扩增仪中，指令设定程序开始工作。
（3） 反应条件： ① 50℃，30 min。
② 94℃，2 min。
③ 94℃，50s；58℃，50s；72℃，60s； 35个循环。
④ 72℃，8 min。
4．3．4 结果分析和判定
（1） 1．5％琼脂糖凝胶板的制备 称取1．5g 琼脂糖，加入100mL1×TAE（见附一）缓冲液中。加热融化后加5μL（10mg／mL）溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加1×TAE 缓冲液淹没胶面。
（2） 加样 取6～8μLPCR 扩增产物和2μL加样缓冲液（见附二）混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时加标准DNA Marker和空白对照。
（3） 电泳 电压80V～100V，或电流40mA～50mA。电泳30 min～40min。
（4） 结果观察和判定 电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。强阳性样品电泳结果应为三条大小不一的条带，分别为634bp、483bp和278bp。如某一待检样品扩增产物的DNA带至少有一条与以上条带大小相符，同时空白对照无扩增条带，则该样品判定为阳性。
4．4 乳鼠中和试验
4．4．1 材料
4．4．1．1 口蹄疫病毒标准血清
用口蹄疫病毒A、O、C、Asia-Ⅰ型标准毒株经多次免疫制备的特异性豚鼠抗血清，于56℃水浴灭活30min，呈透明的浅黄色液体。
4．4．1．2 待检样品
送检样品主要为猪、牛、羊等病畜唇部、舌面、蹄部、乳房等部位的新鲜水泡皮3～5g或水泡液0．5g以上。送检样品经接种乳鼠传代增殖病毒。
4．4．1．3 乳鼠 2～3日龄乳鼠。
4．4．1．4 主要仪器和器材
冰箱、温箱、离心机、注射器、乳钵、吸管、试管等。
4．4．2 操作程序
4．4．2．1 待检病毒液的制备
将送检样品用pH7．5、0．04mol／L PBS液洗2～3次，至病料表面污物彻底被冲洗干净后，用消毒滤纸吸去水分，称重，取3～5g，剪碎，加适量无菌石英砂和适量双抗充分研磨，再用PBS液配制成1：5 悬液（水泡液可加双抗后直接用于接种乳鼠），室温浸毒1h或4℃冰箱过夜，以2000～3000rpm离心10min，取上清液接种2～3日龄乳鼠连续传2～3 代，用发病死亡的乳鼠胴体组织按上述方法制成1：10 悬液，于-30℃冰箱冻融一次，离心后取上清液。
4．4．2．2 待检病毒液毒价的测定
（1） 稀释病毒
用pH7．5、0．04 mol／L PBS液将病毒作10倍连续稀释（例如10（1 上标）-10（8 上标））。
（2） 接种动物
接种时应从最大的稀释度（10（-8 上标））开始，依次向低稀释度进行，每个稀释度接种2～3日龄乳鼠4只，每只乳鼠颈部皮下注射0．2mL。每天观察2次，连续7天记录每个稀释度乳鼠的死亡及存活情况。
（3） 半数致死量的计算
按Reed—Muench氏法计算，详见表4。
由表4 可知该病毒的LD（50 下标）在10（-5 上标）与10（-6 上标）之间，计算公式如下：
LD（50 下标）＝高于50％死亡率稀释度倒数的对数＋距离比例×稀释倍数的对数
高于50％死亡率稀释度倒数的对数＝5
距离比例＝（高于50％死亡率－50）÷（高于50％死亡率－低于50％死亡率）
＝（80－50）÷（80－20）＝0．5
稀释倍数（10）的对数＝1
则LD（50 下标）＝5＋0．5×1＝5．5
查5．5 的反对数等于316200，即当病毒稀释成1：316200 时，注射乳鼠，能使50％乳鼠发生死亡。
表4 半数致死量计算表
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┃ 病毒 ┃ 接种 ┃ 存活数 ┃ 死亡数 ┃ 积累总计 ┃死亡比例 ┃死亡率 ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━┳━━━━┫ ┃（％） ┃
┃ 稀释度 ┃ 只数 ┃ ┃ ┃ 活 ┃ 死 ┃ ┃ ┃
┣━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 10-2 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 16 ┃ 16／16 ┃ 100 ┃
┣━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 10-3 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 12 ┃ 12／12 ┃ 100 ┃
┣━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 10-4 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 8 ┃ 8／8 ┃ 100 ┃
┣━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 10-5 ┃ 4 ┃ 1 ┃ 3 ┃ 1 ┃ 4 ┃ 4／5 ┃ 80 ┃
┣━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 10-6 ┃ 4 ┃ 3 ┃ 1 ┃ 4 ┃ 1 ┃ 1／5 ┃ 20 ┃
┣━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 10-7 ┃ 4 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 8 ┃ 0 ┃ 0／8 ┃ 0 ┃
┣━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 10-8 ┃ 4 ┃ 4 ┃ 0 ┃ 12 ┃ 0 ┃ 0／12 ┃ 0 ┃
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4．4．2．3 待检病毒液的稀释
待检病毒液按200LD（50 下标）进行稀释。
4．4．2．4 标准血清的稀释
口蹄疫病毒O、A、C、Asia-Ⅰ型豚鼠高免血清，用pH7．5、0．04 mol／L PB液作1：5 稀释。
4．4．2．5 病毒液和血清中和
取被检病毒液1mL分别与等量稀释的A、O、C、Asia－Ⅰ型高免血清于试管中混合，37℃温箱孵育1h。
4．4．2．6 接种动物
选2～3日龄乳鼠，分为A、O、C、Asia－Ⅰ型四组，每组一窝鼠，颈背部皮下注射0．2mL／只，接种4只。同时设病毒液、健康乳鼠、PB液和血清对照组各2只（见表5）。每窝以1只母鼠哺乳。
4．4．2．7 观察
接种后观察5～7d，每天记录2次。
表5 试验设计及分组
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┃ 组 ┃ 血清型 ┃ 谢验组乳鼠 ┃血清对照乳 ┃ 病毒液对照乳鼠┃PB液对照乳鼠 ┃健康对照乳鼠 ┃
┃ 别 ┃ ┃ （只） ┃ 鼠（只） ┃ （只） ┃ （只） ┃ （只） ┃
┣━━━╋━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 1 ┃ O ┃ 4 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃
┣━━━╋━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 2 ┃ A ┃ 4 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃
┣━━━╋━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 3 ┃ C ┃ 4 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃
┣━━━╋━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 4 ┃ Asia—Ⅰ ┃ 4 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ┃
┗━━━┻━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━┛
4．4．3 结果判定
检查对照组：病毒液对照乳鼠发病死亡，健康对照、血清对照和PB液对照乳鼠健康。如O型血清试验组乳鼠被保护（健康），其它各型组乳鼠发病死亡，则被检病料为口蹄疫病毒O型。依次类推，判定其它病毒型。
4．5 微量补体结合试验
4．5．1 材料（主要试剂和仪器）
4．5．1．1 样品采集和抗原制备：
（1）样品采集
疑似FMDV感染动物的水泡皮和水泡液可直接作为定型材料。如病料量少或不新鲜，研磨加0．04mol／L PBS（pH7．2～7．4）制成1：5 或1：10的悬液，先接种3～4日龄乳鼠，并视乳鼠发病情况连续传1～3 代，待乳鼠出现FMDV所致典型症状濒死或死亡后，剖解病死或濒死乳鼠（去皮、头、爪及内脏）后的胴体（主要是骨骼肌）作为检测样品。胴体加甘油／PBS后置-30℃或-70℃可长期保存。也可用病料悬液或乳鼠组织1：10悬液接种细胞培养物，以呈现典型FMDV致细胞病变（CPE）的细胞培养液作为检测样品。
（2）抗原制备
在无菌室内将水泡皮或乳鼠胴体用PBS 洗净，用灭菌滤纸吸干后称重。放在灭菌研钵中先剪碎，后加灭菌石英砂研磨。加PBS（pH7．4）制成1：4 悬液。水泡液也以PBS液1：4稀释，可与组织悬液合并。室温浸毒2h以上，或4℃冰箱过夜。3000r／min离心10min。分离出上清液，58℃水浴灭能40min。再3000r／min离心10min，取上清液为待检抗原。
4．5．1．2 抗体
口蹄疫病毒O、A、和Asia－Ⅰ型，及猪水泡病病毒（SVDV）豚鼠高免血清，由农业部指定单位提供，按说明书使用。
4．5．1．3 补体
健康成年公豚鼠新鲜血清。加保存液（Richardson’液）后，可4℃保存6个月。使用前滴定效价。
4．5．1．4 溶血素
兔抗绵羊红细胞抗血清，由农业部指定单位提供。使用前滴定效价。
4．5．1．5 红细胞
成年健康绵羊红血球。试验当天制备2．8％工作液和敏化红细胞。
4．5．1．6 主要仪器和器材
“U”形底96孔微量滴定板，微量可调移液器及配套吸头，可插入微量板的离心机，光电比色计。
实验室常规器皿：如试管和管架，吸管，离心管，三角烧瓶，各种大小的玻璃或塑料瓶（管）等。
4．5．1．7 缓冲液
（1）5倍巴比妥缓冲液（VB）
巴比妥酸 5．75g
巴比妥钠 3．75g
NaCl 85．0g
CaCl（2 下标） 0．28g
MgCl（2 下标）·6H（2 下标）O 1．68g
蒸馏水 2000mL
先将巴比妥酸溶于500mL加热至沸的蒸馏水中。冷却后加入其它成分，加蒸馏水至2000mL，充分混匀。分装入带塞的瓶中，103kpa 蒸汽灭菌15min。塞紧瓶塞，4℃保存。
（2）微量补体结合试验缓冲液（VBD）
5倍巴比妥缓冲液 100mL
蒸馏水 400mL
用NaHCO（3 下标）调整pH至7．4。试验当天现配现用。
（3）补体保存液（Richardson’液）
A液： H（3 下标）BO（3 下标）（硼酸） 0．93g
Na（2 下标）B（4 下标）O（7 下标）·H（2 下标）O（硼砂） 2．29g
山梨醇 11．47g
饱和NaCl溶液加至100mL混匀，室温保存。
B液： Na（2 下标）B（4 下标）O（7 下标）·H（2 下标）O（硼砂） 0．75g
NaN（3 下标）（叠氮钠） 0．81g
饱和NaCl溶液加至100mL混匀。室温保存。
使用方法：8份豚鼠血清加1份A液、1份B液，混匀后置4℃可保存6个月。
用补体时，取1份保存补体加7份蒸馏水，即1：10 稀释补体。
4．5．2 预备试验
4．5．2．1 2．8％红细胞悬液的制备
将脱纤的（绵羊）红细胞用VBD洗涤3次。每次加5倍于红细胞体积的VBD轻摇混匀，1500r／min离心10min，吸去上清液后再加入VBD，反复3次，最后吸取2．8mL红细胞泥加入盛有97．2mLVBD的三角瓶中，充分混匀。取0．5mL红细胞悬液，加4．5mL蒸馏水，对照管加5mL蒸馏水，用波长625nm滤光片的光电比色计测定该初配制的红细胞悬液的OD值。按照标准化2．8％红细胞悬液的OD值＝42，用下列公式校正（标准化）该初配红细胞悬液的浓度。
计算公式：[初配红细胞悬液用VBD量（mL）×0D值]÷标准OD值（42）
＝应加缓冲液的总数（mL）
例如： 初配红细胞悬液100mL测定OD值＝45（大于标准值42）
按公式计算 [97．2×45]÷42＝104， 104－97．2＝7．8，即应补加7．8mL缓冲液于红细胞悬液中，再测OD值将符合标准值42。
若初配红细胞悬液的OD值小于42，可将该红细胞悬液离心，根据公式计算，取出多余的缓冲液，再测OD值。
4．5．2．2 0-100％溶血标准孔的制备
（1）血红素：取1mL2．8％红细胞悬液，加7mL蒸馏水，充分摇动直到红细胞全部溶解。再加2mLVB，混匀。
（2）0．28％红细胞：取1mL2．8％红细胞悬液，加9mLVBD，混匀。
表6 标准溶血百分比 单位：μL
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┃ 孔位 ┃ A1 ┃ A2 ┃ A3 ┃ A4 ┃ A5 ┃ A6 ┃ A7 ┃ A8 ┃ A9 ┃ A10 ┃ A11 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ 血红素 ┃ 0 ┃ 20 ┃ 40 ┃ 60 ┃ 80 ┃ 100 ┃ 120 ┃ 140 ┃ 160 ┃ 180 ┃ 200 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ 0．2876红细胞 ┃ 200 ┃ 180 ┃ 160 ┃ 140 ┃ 120 ┃ 100 ┃ 80 ┃ 60 ┃ 40 ┃ 20 ┃ 0 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ 溶血百分比 ┃ 0 ┃ 10 ┃ 20 ┃ 30 ┃ 40 ┃ 50 ┃ 60 ┃ 70 ┃ 80 ┃ 90 ┃ 100 ┃
┗━━━━━━━━┻━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┛
（3）溶血标准孔的制备：按表6 所列剂量将血红素和红细胞悬液加入微量板A1-A11各孔。1000r／min离心10min。A6孔为50％溶血孔，其红细胞沉淀图形的大小和溶血颜色深浅（OD值）作为微量补体结合试验判定的比对标准。
4．5．2．3 棋盘式滴定溶血素／补体
（1）稀释溶血素
①1：100 稀释液：0．1mL溶血素加9．9mLVBD。
②按表7所示方法，制备8个溶血素稀释液。
表7 溶血素稀释液制备 单位：mL
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┃ 管号 ┃溶血素浓度 ┃溶血素量 ┃VBD量 ┃溶血素稀释度┃溶血素最终浓度┃
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┃ A ┃ 1：100 ┃ 1．0 ┃ 1．5 ┃ 1：250 ┃ 1／500 ┃
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ B ┃ 1：100 ┃ 0．5 ┃ 2．0 ┃ 1：500 ┃ 1／1000 ┃
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ C ┃ 1：100 ┃ 1．0 ┃ 9．0 ┃ 1：1000 ┃ 1／2000 ┃
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ D ┃ 1：1000 ┃ 2．0 ┃ 1．0 ┃ 1：1500 ┃ 1／3000 ┃
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ E ┃ 1：1000 ┃ 1．5 ┃ 1．5 ┃ 1：2000 ┃ 1／4000 ┃
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ F ┃ 1：1000 ┃ 1．0 ┃ 1．5 ┃ 1：2500 ┃ 1／5000 ┃
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ G ┃ 1：1000 ┃ 0．5 ┃ 1．0 ┃ 1：3000 ┃ 1／6000 ┃
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ H ┃ 1：1000 ┃ 0．5 ┃ 1．5 ┃ 1：4000 ┃ 1／8000 ┃
┗━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━┛
（2）制备敏化红细胞
①取8支试管，写明标签A-H。将上述8个溶血素稀释液分别取1mL移入相应编号的试管中。
②各管再加入1mL标准化的2．8％红细胞悬液。混匀。溶血素最终浓度如表7所列。
③25℃孵育20分钟。
表8 补体稀释液制备 单位：mL
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┃ 管号 ┃ 稀释用补体浓度┃ 补体加入量┃ VBD量 ┃补体最终浓度┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 1 ┃ 1：10 ┃ 2．0 ┃ 3．0 ┃ 1：25 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 2 ┃ 1：10 ┃ 1．0 ┃ 4．0 ┃ 1：50 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 3 ┃ 1：25 ┃ 1．0 ┃ 2．0 ┃ 1：75 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 4 ┃ 1：50 ┃ 1．5 ┃ 1．5 ┃ 1：100 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 5 ┃ 1：25 ┃ 0．5 ┃ 2．0 ┃ 1：125 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 6 ┃ 1：50 ┃ 1．0 ┃ 2．0 ┃ 1：150 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 7 ┃ 1：25 ┃ 0．5 ┃ 3．0 ┃ 1：175 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 8 ┃ 1：100 ┃ 1．0 ┃ 1．0 ┃ 1：200 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 9 ┃ 1：50 ┃ 0．5 ┃ 2．0 ┃ 1：250 ┃
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┃ 10 ┃ 1：150 ┃ 1．0 ┃ 1．0 ┃ 1：300 ┃
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┃ 11 ┃ 1：175 ┃ 1．0 ┃ 1．0 ┃ 1：350 ┃
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┃ 12 ┃ 1：100 ┃ 0．5 ┃ 1．5 ┃ 1：400 ┃
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（3）稀释补体
① 1：10 稀释补体：0．5mL新鲜补体（豚鼠血清）加4．5mLVBD。或0．5mL保存补体加3．5mL蒸馏水，就是1：10稀释补体。
② 按表8 所示，制备12个补体稀释液
（4）棋盘式滴定
① 用“U”形底微量板。首先每孔（全部96孔）加50μLVBD缓冲液。
② 将12个补体稀释液移加入微量板1～12列。即将管1（1／25稀释）补体加入第1列（A1～H1）8孔，每孔50μL；将管2（1：50 稀释）补体加入第2列（A2～H2）8孔，每孔50μL；依此类推，将12管补体分别加入12列各孔中。
③ 将8管以8个不同浓度溶血素敏化的红细胞悬液依次加入微量板A～H行。即将A管（溶血素1：500 稀释）敏化红细胞加入A行（A1～A12）12孔，每孔25μL；将B管（溶血素1：1000 稀释）敏化红细胞加入B行（B1～B12）12孔，每孔25μL；依此类推，直至8管敏化红细胞分别加入8行各孔中。
④37℃振荡40min，1000r／min离心10min。
⑤结果判定：确定补体最高稀释度时，引起50％溶血的溶血素最高稀释度。该补体最高稀释度（如1：200）即为补体效价，4倍效价为补体工作液（1：50）。该溶血素最高稀释度（如1：2000）即为溶血素效价，2倍效价为溶血素工作液（1：1000）。
4．5．3 定型补体结合试验
4．5．3．1 布局：
牛病料鉴定“O”、“A”和“Asia-Ⅰ”型 。“Asia-Ⅰ”型的定型按相关技术规范执行。
定型布局如表2-4 所列。A1～A4 为“O”型，B1～B4 为“A型”。A5、A6 为“O”“A”型血清对照，B7 为抗原对照，A8 为补体对照，A9 为空白对照。
表9 定型补体结合试验布局
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A ○ ○ ○ ○ ◇ ◆ △ ※
B ● ● ● ● ◎
4．5．3．2 主要操作步骤： 补体结合试验各试剂加入量和次序列于表9。
（1）加VBD稀释液：A2～A4、B2～B4每孔各加25μL；
对照A5、A6、B7孔各加25μL；A8孔加50μL；A9孔加100μL。
（2）加高免抗血清
①稀释血清：将“O”、“A”两型血清分别以VBD作1：8 稀释。
②A1、A5孔加1：8“O”型血清25μL／孔， A2孔加50μL／孔；
B1、B5孔加1：8“A”型血清25μL／孔， B2孔加50μL／孔。
③从A2 到A4孔作1：1．5 连续稀释：用微量移液器先将A2孔中的25μLVBD和50μL血清混匀，然后吸出50μL移入A3孔；混匀后再吸出50μL移入A4孔；混匀后吸出50μL弃去。A1 到A4孔的血清稀释度分别为1：8、1：12、1：18、1：27。
B2到B4孔作同样连续稀释。
表10 FMDV 微量补体结合试验 单位为微升
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┃ 血清型 ┃ O ┃ A ┃ 对照 ┃
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┃ 孔号 ┃ A1 ┃ A2 ┃ A3 ┃ A4 ┃ B1 ┃ B2 ┃ B3 ┃ B4 ┃ A5 ┃ A6 ┃ B7 ┃ A8 ┃ A9 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━┫
┃ 血清稀释度 ┃ 1：8 ┃ 1：12 ┃ 1：18 ┃ 1：27 ┃ 1：8 ┃ 1：12 ┃ 1：18 ┃ 1：27 ┃ 1：8 ┃ 1：8 ┃ ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━┫
┃ 缓冲液 ┃ 0 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 0 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃25 ┃50 ┃100 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━┫
┃ ┃ ┃ 50 ┃50 ┃ 50 ┃ 50 ┃50 ┃50 ┃50 ┃ 25 ┃ 25 ┃ ┃ ┃ ┃
┃ 高免血清量 ┃ 25 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ ┃ 弃50 ┃ ┃ ┃ ┃ 弃50 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━┫
┃ 被检抗原 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ ┃ ┃ 25 ┃ ┃ ┃
┣━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━╋━━━╋━━━━┫
┃ 补体量 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ 50 ┃ ┃
┣━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━┻━━━┻━━━━┫
┃ 37℃振荡60min ┃
┣━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━┳━━━┳━━━━┫
┃ 敏化红细胞 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃ 25 ┃
┣━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━┻━━━┻━━━━┫
┃ 37℃振荡30min ┃
┣━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━┳━━━┳━━━━┫
┃ 结果 ┃ + ┃ ┃ ┃ ┃++++ ┃++++ ┃ ++ ┃ + ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ++++ ┃
┣━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━┻━━━┻━━━━┫
┃ 注：“—”完全溶血；“++++”完全不溶血，“++”50％溶血，“+”75％溶血。 ┃
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（3）加抗原：除对照A5、A6、A8、A9孔外，各孔加待检样品25μL。
（4）加补体：除空白对照A9孔外，各孔加补体工作液50μL。
（5）37℃振荡60min。
（6）制备敏化红细胞和加样：2．8％红细胞悬液与溶血素工作液等体积混合，25℃敏化20min。各反应孔加25μL／孔。
（7）37℃振荡30min，1000r／min离心30min。
4．5．4 结果判定
4．5．4．1 试验成立的条件：
当空白对照孔（A9）完全不溶血（＋＋＋＋）；
补体对照孔（A8）完全溶血（-）；
血清对照孔（A5和A6）和抗原对照孔（B7）完全溶血（-），试验才成立。
4．5．4．2 判定血清型：
（1）若某血清型4孔完全溶血（-），或仅含最高浓度血清的第1孔，被阻止溶血不足50％，如表10所示A1～A4孔， 则判定为“阴性”，即不是“O”型。
（2）若某血清型4孔中3孔或4孔50％以上被阻止溶血（＋＋、＋＋＋）或完全不溶血（＋＋＋＋），
如表10所示B1-B4孔，则判定为阳性，即该病料为FMDV“A”型。
4．6 非结构蛋白抗体ELISA
4．6．1 仪器和材料准备
4．6．1．1 酶标板、微量移液器，孵育箱，样品稀释板，量筒，酶标仪，吸水纸等。
4．6．1．2 使用溶液的配制：方法见附录A。
4．6．1．3 间接ELISA 抗原，酶标抗体。
4．6．1．4 抗原包被板制备：方法见附录B。
4．6．2 操作步骤
4．6．2．1 在稀释板上按1：20 的体积比稀释待检血清（6uL 待检血清＋120μL样品稀释液）。设阴性和阳性对照。
4．6．2．2 分别在诊断板的相应孔中加入阳性对照（2孔）和阴性对照（2孔）原液（不用稀释）、预稀释的待检动物血清各100μL。充分混匀后，贴上封口胶片，置37℃孵育30min。
4．6．2．3 小心揭掉封口胶片，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30s，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍净。
4．6．2．4 每孔加入酶结合物液100μL，贴上封口胶片，置37℃孵育30min。
4．6．2．5 重复操作步骤4．6．2．3。
4．6．2．6 每孔加入底物溶液（见附录A．6），轻振混匀，置37℃避光显色15min。
4．6．2．7 每孔加入终止液（见附录A．8），每孔50μL，轻轻振荡，置酶标仪450nm波长处测定各孔OD（450 下标）值。
4．6．3 结果判定
4．6．3．1 试验结果同时符合下列条件，方为有效：
（1）两孔的阴性对照OD平均值应≤0．15；
（2）每孔阳性对照OD值均≥0．60；
计算临界值＝（阳性对照孔OD（450 下标） 均值-阴性对照孔OD（450 下标）均值）×0．2＋阴性对照孔OD（450 下标）均值，判定检测结果。
4．6．3．2 被检样品OD（450 下标）值＜临界值，为FMDV-NS 抗体阴性；
4．6．3．3 样品OD（450 下标）值≥临界值，为初试FMDV-NS 抗体阳性；
4．6．3．4 初试阳性的样品应再进行双孔复试，若任意一孔或两孔均为阳性，则视为FMDV-NS抗体阳性；若两孔均为阴性则视为FMDV-NS 抗体阴性。
4．6．3．5 FMDV-NS 抗体阴性，说明该动物未感染口蹄疫病毒（急性发病期除外）；FMDV-NS抗体阳性，说明该动物曾感染和携带口蹄疫病毒。
4．7液相阻断-酶联免疫吸附试验（LpB-ELISA）
4．7．1 材料
4．7．1．1 样品采集
动物血清样品的采集、保存和运送方法和要求详见附录A。
4．7．1．2 试剂和仪器
（1）U 形底板
96-孔U 形底聚丙烯微量板，抗原／血清液相阻断反应专用。
（2）对照血清
含有某型FMDV 抗体的牛或猪血清。预先测定其抗体滴度，作适当稀释后，其阻断定量抗原的程度分别为45～90％（阳性对照）和0～45％（阴性对照）。
4．7．2 试验方法
4．7．2．1 包被固相
用包被缓冲液稀释兔抗血清至工作浓度，ELISA板每孔加50μL。室温振荡30min，然后置湿盒中4℃过夜，或37℃振荡2h（当天试验）。
4．7．2．2 抗原／抗体（对照和待检血清）的预先结合（液相阻断）
（1）布局 各对照和待检血清在LpB-ELISA中的布局如表11 所示。
表11．LpB-ELISA 布局
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A C++ C++ S1 1 S9 9 S17 17 S25 25 S27 27
B C++ C++ S2 2
C C+ C+ S3 3
D C+ C+ S4 4
E C- C- S5 5 S26 26 S28 28
F C- C- S6 6
G Ag Ag S7 7
H Ag Ag S8 8 S16 16 S24 24
（2）C＋＋空白对照孔（A1、A2、B1、B2）加80μL／孔稀释液A。
Ag抗原对照孔（G1、G2、H1、H2）加40μL／孔稀释液A。
（3）阳性对照血清用稀释液A 适当稀释后分别作为C＋和C-对照。
例如：1：50 稀释加入C＋对照孔（C1、C2、D1、D2）；
1：200 稀释加入C-对照孔（E1、E2、F1、F2）。
（4）检测（筛选）试验时待检血清的稀释和加样
待检血清样品先以稀释液A作1：16 稀释，混匀后按表11（第3～8列）所示逐个加入，每份样品加2孔，每孔40μL。
（5）滴定试验时待检血清的稀释和加样
① 首先每孔加40μL稀释液A，如表11中第9～12列各孔。
② 待检血清先作1：8 稀释，混匀后加入A行（A9、A10 或A11、A12）或E行（E9、E10 或E11、E12）2孔，每孔40μL。
③ 从A→D、或E→H行作2倍连续稀释，最后弃去40μL。待检血清形成1：16→1：128系列稀释。
（6）抗原稀释和加样
以稀释液A 将抗原稀释至2倍工作浓度，混匀后加入除C＋＋对照4孔外的所有各孔，40μL／孔。
（7）加盖后室温振荡30min，然后置湿盒中4℃过夜。或37℃振荡2h（当天试验）。
4．7．3 转移抗原／血清混合液
4．7．3．1 将包被的ELISA板和抗原／血清混合液（U 形底）板从4℃湿盒中取出，放在试验台上（室温）20～30min；洗涤ELISA板5次，扣干。
4．7．3．2 将抗原／血清混合液转移到ELISA板相应各孔中，每孔50μL。
4．7．3．3 37℃振荡60min。洗涤5次，扣干。
4．7．3．4 加检测抗体
以稀释液B 将豚鼠抗血清稀释至工作浓度。
混匀后每孔加50μL，37℃振荡60min，洗涤5次，扣干。
4．7．3．5 加酶结合物
以稀释液B 将酶结合物稀释至工作浓度，混匀后每孔加50μL。
37℃振荡40min，洗涤5次，扣干酶标板。
4．7．3．6 加底物溶液
临加样前，按每6mL（每块板用量）3．3mmol／L OPD加30μL30％双氧水，混匀后每孔加50mL，37℃振荡15min。
4．7．3．7 加终止液
每孔加50μL1．25mol／L H（2 下标）SO（4 下标），轻轻振荡混匀。
4．7．3．8 判读结果
先用肉眼观察全板的显色状况，如各对照组反应液的颜色与设计大体相符，初步判定试验成立后再用酶标仪测定OD值。
4．7．4 数据分析和结果判定
为了便于说明，假设28 份血清样品的检测结果列于表12。第1-2列是对照，第3-8列是24 份血清的检测结果，第9-12列是4 份血清的滴定结果。
4．7．4．1 试验初步成立的条件
试验成立的首要条件是：4个抗原对照OD值中，有3个在设定范围内（1．50±0．49），或其中2个很接近。
4．7．4．2 试验完全成立的条件
计算抗原对照平均OD值：以居中的2个OD值求平均值。
如表12 所示（1．59＋1．63）÷2＝1．61
按公式计算对照各孔的阻断百分率（PI值）
PI＝100－[某孔OD值÷抗原对照平均OD值×100]
如C＋＋4个PI值中的3个＞90；C＋ 4个PI值中的3个介于45～90；
C-4个PI值中的3个介于0～45，则试验完全成立。
表12 LpB-ELISA血清抗体OD值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ A 0．10 0．07 0．78 0．73 1．09 1．12 1．11 1．19 0．31 0．34 0．47 0．53 ┃
┃ B 0．09 0．12 0．67 0．70 0．60 0．55 0．40 0．32 0．48 0．53 0．78 0．88 ┃
┃ C 0．43 0．46 0．90 0．98 1．21 1．28 0．77 0．68 0．87 0．94 0．99 1．10 ┃
┃ D 0．54 0．60 0．88 0．81 1．56 1．51 1．09 0．99 1．33 1．38 1．45 1．34 ┃
┃ E 1．02 1．12 0．23 0．31 0．89 0．79 0．39 0．48 0．12 0．11 0．09 0．09 ┃
┃ F 0．95 0．99 0．43 0．49 0．27 0．36 0．55 0．59 0．28 0．25 0．21 0．22 ┃
┃ G 1．85 1．59 0．89 0．97 0．12 0．14 0．65 0．82 0．42 0．49 0．36 0．31 ┃
┃ H 1．38 1．63 0．34 0．41 0．22 0．19 0．51 0．70 0．77 0．84 0．79 0．73 ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
表13 相应表12．OD值的PI值（Ag为平均OD值）
1 2 3 4 5 6 7 8
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ C++ 93．8 95．6 S1 51．5 54．7 S9 32．3 30．4 S17 31．0 27．1 ┃
┃ C++ 94．4 92．5 S2 58．4 57．5 S10 62．7 65．8 S18 75．1 80．1 ┃
┃ C+ 73．3 71．4 S3 44．1 39．1 S11 24．8 20．5 S19 52．2 57．8 ┃
┃ C+ 67．5 62．7 S4 45．3 50．3 S12 3．1 7．2 S20 32．3 38．5 ┃
┃ C． 37．6 30．4 S5 85．7 80．7 S13 44．7 50．9 S21 75．8 70．2 ┃
┃ C- 41．0 38．5 S6 73．3 69．5 S14 83．2 77．6 S22 65．8 63．3 ┃
┃ Ag S7 45．9 38．5 S15 92．5 91．3 S23 59．6 49．1 ┃
┃ Ag 1．61 S8 78．9 74．5 S16 87．3 88．2 S24 68．3 55．9 ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
血清稀释度 9 10 11 12
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 1／32 S25 80．7 78．9 S27 70．8 67．1 ┃
┃ 1／64 70．2 67．1 51．5 45．3 ┃
┃ 1／128 45．9 41．6 - - ┃
┃ 1／256 - - - - ┃
┃ 1／32 S26 - - S28 - - ┃
┃ 1／64 - - - - ┃
┃ 1／128 73．0 69．6 - - ┃
┃ 1／256 52．2 47．8 50．9 54．7 ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
4．7．4．3 判定检测（筛选）试验结果
本试验的判定界限设定为：50％阻断，即PI值≥50为“＋”。
抗体滴度≥1：45的血清判定为（FMDV 某型抗体）阳性。
（1）如某一待检血清的2个PI值都＜50，则该样品判定为阴性，血清抗体滴度＜1／32。如表13中S3、S9、S11等。
（2）如某一待检血清的2个PI值，1个≥50，另1个＜50，则该样品判定为阴性，血清抗体滴度为1：32。如表13中S4、S13 等。
（3）如某一待检血清的2个PI值都≥50，则该样品判定为阳性，血清抗体滴度≥1：45，或再进一步滴定。如表13中S1、S5、S8、S15等。
4．7．4．4 判定滴定试验结果
（1）如某一待检血清的4个稀释度（1／32～1／256）8个孔的PI值都＜50，则该样品判定为阴性，血清抗体滴度＜1／32。同4．7．4．3（1）。
（2）如第1个血清稀释度（1／32）的2个PI值，1个≥50，另1个和其余6个都＜50，则该样品判定为阴性，血清抗体滴度为1／32。同4．7．4．3（2）。
（3）如1／32 稀释血清的2个PI值都≥50，其余6个都＜50，判定该待检血清为阳性，血清抗体滴度为1／45。
（4）若高于1：32 稀释血清的PI值≥50，该样品肯定为阳性，其血清抗体滴度的判定可参考表13。
如表13 所示S25-S28 的抗体滴度分别为：
S25：1／90； S26：1／256； S27：1／64； S28：1／360。
表14 血清抗体滴度
┏━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 血清 ┃ 滴定试验8个孔中，1～8孔PI值≥5C ┃（+）对应的抗体滴度 ┃
┃ ┣━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━╋━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┫
┃ 稀释度 ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ┃ 7 ┃ 8 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 1：32 ┃ + - ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 1：64 ┃ - - ┃ - - ┃ + - ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 1：128 ┃ - - ┃ - - ┃ - - ┃ - - ┃ + - ┃ + + ┃ + + ┃ + + ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 1：256 ┃ - - ┃ - - ┃ - - ┃ - - ┃ - - ┃ - - ┃ + - ┃ + + ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 抗体滴度 ┃ 1：32 ┃ 1：45 ┃ 1：64 ┃ 1：90 ┃ 1：128 ┃ 1：180 ┃ 1：256 ┃ 1：360 ┃
┗━━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┛
4．8 病毒感染相关（VIA）抗原琼脂凝胶免疫扩散试验（VIA-AGID）
4．8．1 材料
4．8．1．1 血清样品的采集和处理见附录A。
4．8．1．2 VIA 抗原。
4．8．1．3 VIA 抗体阳性（对照）血清
4．8．1．4 缓冲液
0．02mol／L Tris-0．15mol／L 氯化钠（pH7．6）
Tris 2．42g
氯化钠（NaCl） 3．80g
蒸馏水 1000mL
用浓盐酸调整pH为7．6。
4．8．1．5 模板：用有机玻璃板制作。本试验设计了两种不同孔数的模板（图1 和图2 所示）。
Ⅰ型模板由1个中央孔和6个均匀分布的周边孔组成，孔径和孔间距均为4mm。Ⅱ型模板为适应大批量检测需要设计的，由4组Ⅰ型模板组成。
① ② ③ ④
① ② ⑤ ● ◎ ● ⑥
◎ ● ◎ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
③ ④
●——抗原孔； ●——抗原孔；
◎——阳性对照孔； ◎——阳性对照孔；
①～④——待检样品孔 ①～⑩——待检样品孔
图1 Ⅰ型模板 图2 Ⅱ型模板
4．8．1．6 打孔器：与模板配套制作的，外径为4mm的不锈钢管。
4．8．1．7 平皿：常用直径6cm的平皿，要求底面平整光滑。
4．8．2 试验操作
4．8．2．1 琼脂糖凝胶板的制备
称取1．0g琼脂糖（电泳用），置于150mL容量的三角烧瓶中，再加入100mL缓冲液。将三角烧瓶置于磁力搅拌器上，边搅拌边加热至沸腾使琼脂糖完全熔化。将熔化的琼脂糖溶液注入平皿中，每个平皿加 8mL，凝胶板厚约3mm。待自然冷却凝固后，盖好平皿后倒置放在湿盒中，4℃冰箱保存。
4．8．2．2 打孔
按检测样品的数量选用模板。揭开平皿，将模板放在凝胶板上方，打孔器垂直插入模板孔中并穿透凝胶直至底面。打完孔后拿开模板，用细针头轻轻挑出孔中的凝胶块，将平皿底部在酒精灯上略烤封底。
4．8．2．3 加样
用微量移液器每孔加样20μL。抗原孔（中央孔）加VIA 抗原；对照孔（Ⅰ型中央孔左、右侧的2个周边孔，Ⅱ型2个中央孔之间的孔）加VIA 阳性对照血清；其余各孔（Ⅰ型4孔／板，Ⅱ型10孔／板）加待检血清样品。
4．8．2．4 扩散
加完样后盖上平皿，放入湿盒中。置于室温20～25℃任其扩散。
4．8．3 结果判定
4．8．3．1 加样后24h开始观察，每天观察并记录，至120h时判定结果。当阳性对照与抗原孔之间出现清晰沉淀线时，本试验成立。
4．8．3．2 待检血清与抗原孔之间出现沉淀线，并与阳性对照沉淀线末端相融，该血清判定为“阳性”。
4．8．3．3 待检血清与抗原孔之间虽然未出现沉淀线，但阳性对照沉淀线的末端弯向待检血清孔，该血清判定为弱阳性。
4．8．3．4 待检血清与抗原孔之间未出现沉淀线，该血清判定为阴性。
4．8．3．5 血清孔之间出现的沉淀线，为非特异性反应。
附录A
（规范性附录）
口蹄疫非结构蛋白抗体的酶联免疫吸附试验使用溶液的配制
A．1 碳酸盐缓冲液（0．05mol／L、pH9．6，CBS）
碳酸钠 1．59g
碳酸氢钠 2．93g
用双蒸水溶解至1000mL，于4℃保存，不超过1个月。
A．2 磷酸盐冲液（0．01mol／L、pH7．4，PBS）
氯化钠 8g
磷酸二氢钠 0．2g
磷酸氢二钠（Na（2 下标）HPO（4 下标）·12H（2 下标）O） 2．9g
氯化钾 0．2g
加蒸馏水至 1000mL
A．3 洗液（含0．05％Tween-20的0．01mol／L、pH7．4的PBS，即PBST）
Tween-20 0．5mL
加0．01mol／L、pH7．4的PBS至 1000mL
A．4 封闭液（含0．5％BSA 的PBST）
牛血清白蛋白（BSA） 0．5g
加洗液至 100mL
4℃存放，避光。
A．5 稀释液（含0．1％BSA的PBST）
牛血清白蛋白（BSA） 0．1g
加洗液至 100mL
4℃存放，避光。
A．6 间接ELISA底物缓冲液（磷酸氢二钠-柠檬酸，pH5．4）
0．2mol／L磷酸氢二钠（Na（2 下标）HPO（4 下标）·12H（2 下标）O） 26．7mL
0．1mol／L磷酸钠 24．3mL
双蒸水 49mL
准确称量40mg邻苯二胺（OPD），溶解后置暗处保存，临用前加入30％过氧化氢150μL。
用时现配，避光。
A．7 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液（0．05mol／L pH7．6）
0．1mol／L Tris 250mL
0．1mol／L 盐酸 192．5mL
双蒸水 57．5mL
A．8 间接ELISA 终止液
浓硫酸 11．1mL
蒸馏水 88．9mL
附录B
（规范性附录）
口蹄疫非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验抗原包被板制备
抗原包被板也称诊断板，将基因工程表达口蹄疫非结构蛋白抗原用0．05mol／L，pH9．6碳酸盐缓冲液（见附录第A．1章）稀释成3μg／mL包被96孔聚苯乙烯微量板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜，用洗液洗涤（见附录第A．3章）3次，用封闭液（见附录第A．4章）于37℃湿盒内封闭60min，用洗涤液洗涤3次，干燥后即为诊断板，置4℃冰箱备用。
高致病性禽流感诊断技术规范
1 范围
本规范规定了高致病性禽流感的采样、临床及病理学诊断和实验室检验方法和技术要求。
本规范适用于高致病性禽流感的诊断与监测。
2 术语和定义
2．1 高致病性禽流感
6周龄鸡的静脉接种致病指数（IVPI）大于1．2的A型禽流感病毒，或核苷酸测序证明其血凝素基因裂解位点上有多碱性氨基酸的H5及H7亚型的A型禽流感病毒。
3 样品采集与处理
3．1 活禽采集血清、气管和泄殖腔拭子等样品；小珍禽采集新鲜粪便；死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品。
