注：调入、调出数量指进出无疫区的数量，本无疫区区域内流通数量不计在内。
第四部分 预防与监测
1 口蹄疫免疫技术规范
2 高致病性禽流感免疫技术规范
3 鸡新城疫免疫技术规范
4 猪瘟免疫技术规范
5 样品采集、保存及运输技术规范
6 口蹄疫诊断技术规范
7 高致病性禽流感诊断技术规范
8 鸡新城疫诊断技术规范
9 猪瘟诊断技术规范
10 口蹄疫监测技术规范
11 高致病性禽流感监测技术规范
12 鸡新城疫监测技术规范
13 猪瘟监测技术规范
口蹄疫免疫技术规范
1 范围
本规范规定了牲畜口蹄疫灭活疫苗的运输、贮存、使用、免疫程序和免疫效果评价的技术要求。
本规范适用于牲畜口蹄疫的免疫接种。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本规范。
2．1 批次
具有相同代码、组成均一的全部疫苗。
2．2 剂量
标签上标定的特定年龄动物，经特定免疫途径，一次接种疫苗的使用剂量。
2．3 效力
使用疫苗所产生的特异的免疫保护能力。
3 疫苗选用和贮运
3．1 选择与流行毒株相同血清型的口蹄疫疫苗用于牲畜的预防接种。
3．2 根据饲养牲畜的数量，准备足够完成一次免疫接种所需要的指定厂家生产的同一批次的疫苗。
3．3 疫苗的运输和贮存
3．3．1 疫苗应包装良好，2～8℃冷藏运输，冬季运输要注意防冻。
3．3．2 疫苗应在2～8℃避光保存。
3．3．3 疫苗的运输和保存应有完善的管理制度。
3．3．4 疫苗的入库和发放必须做好记录。
3．3．5 每批次疫苗应留样。
4 疫苗使用要求
4．1 牲畜要求
待接种的牲畜经临床观察应未见异常。凡有病、体弱的牲畜不应接种。患病牲畜待康复后再按规定接种。怀孕牲畜、仔畜的免疫应严格按疫苗使用说明书要求进行。
4．2 疫苗检查
4．2．1 疫苗使用前要仔细检查外包装是否完好，标签是否完整，包括疫苗名称、生产批号、批准文号、保存期或失效日期、生产厂家等。
4．2．2 出现瓶盖松动、疫苗瓶裂损、破乳、超过保存期、色泽与说明不符、瓶内有异物、发霉的疫苗，不得使用。
4．2．3 接种前将疫苗升至室温，充分混合均匀，但要防止气泡影响免疫剂量的准确性。
4．3 接种器械
4．3．1 仔猪使用12～16号（2．5cm）针头，育成猪和成年猪使用16～18号（4．0cm）针头，牛使用16～20号（4．0cm）针头，绵羊和山羊使用12～18号（2．5～4．0cm）。
4．3．2 注射器和针头应洁净无菌。
4．4 接种安全
4．4．1 首次使用疫苗的地区，建议应选择一定数量牲畜进行小范围试用，观察7～10d，临床无不良反应后，方可扩大接种面。
4．4．2 注射疫苗人员应携带肾上腺素，用于疫苗过敏反应时急救。
4．4．3 发生疫情时，免疫接种应先从安全区域到受威胁区、最后到疫区。
4．5 接种操作
4．5．1 注射部位剪毛后用碘酊或75％酒精棉擦拭消毒，再用挤干的酒精棉擦干消毒部位。
4．5．2 用于接种的疫苗从冰箱取出后，应先预温至室温再进行注射，瓶塞上应固定一只消毒过的针头，其上覆盖酒精棉球。
4．5．3 吸出的疫苗液不可再回注于瓶内，针筒排气溢出的疫苗液应吸积于酒精棉球上，并将其收集于专用瓶内，用过的酒精棉球、碘酊棉球应收集到指定容器内，与疫苗瓶一同进行无害化处理。
4．5．4 疫苗要注入深层肌肉内，牛、羊注射部位在颈侧中部上l／3处；猪选择耳根后，注射时避开耳道。注射时针头与皮肤表面呈45度，避免疫苗的流出。
4．5．5 一支注射器只能用于一种疫苗的接种，接种时针头要逐头／只更换。
4．5．6 注射剂量按疫苗使用说明书规定的剂量。
4．5．7 疫苗在免疫过程中暂停接种时，应低温保存并避免日光直射。
4．5．8 每瓶疫苗启用后，瓶内剩余疫苗用蜡封闭针孔，于2～8℃贮存，超过24h不可再用。
5 推荐免疫程序
5．1 猪的免疫程序
5．1．1 规模化猪场免疫程序
种公猪：每年接种2次。
怀孕母猪：分娩前1个月接种。
仔猪及育成猪：非免疫母猪所产仔猪20日龄首免，30日龄后加强免疫一次，100日龄再接种一次（外调猪可适当顺延）；免疫母猪所产仔猪25-35日龄首免，60日龄二免。
5．1．2 散养猪只免疫程序
种公猪：每年接种2次。
母猪：每年接种2次。
仔猪及育成猪：仔猪断奶时首免，30日龄后加强免疫一次，100日龄再接种一次。
外运猪：出场前30天接种。
5．2 牛、羊的免疫程序
母牛：分娩前2个月接种一次。
犊牛：4月龄首免（30天后加强免疫一次），6个月后二免，以后每6个月免疫一次。
母羊：分娩前4周接种一次。
羔羊：4月龄首免（30天后加强免疫一次），6个月后二免，以后每6个月免疫一次。母羊的秋季免疫应注意选择在配种前4周进行。
6 免疫效果监测
6．1 免疫接种后，应进行免疫抗体水平监测，掌握免疫动态，及时加强免疫。
6．2 各级动物防疫监督机构应对牲畜免疫效果进行监测，并指导免疫工作。
6．3 免疫效果监测应建立记录档案。
高致病性禽流感免疫技术规范
1 范围
本规范规定了高致病性禽流感油乳剂灭活疫苗的运输、贮存、使用、免疫程序和免疫效果评价的技术要求。
本规范适用于H5或其他亚型高致病性禽流感的免疫。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本规范。
2．1 批次
具有相同代码、组成均一的全部疫苗。
2．2 剂量
标签上标定的特定年龄动物，经特定免疫途径，每只禽一次接种的疫苗使用量。
2．3 效力
使用生物制品所产生的特异的免疫保护能力。
3 疫苗选用和贮运
3．1 根据流行的禽流感病毒血凝素（HA）亚型，选择相同亚型的禽流感疫苗用于家禽的预防接种。
3．2 根据饲养家禽的数量，准备足够完成一次免疫接种所需要的指定厂家生产的同一批次的疫苗。
3．3 疫苗的运输和贮存
3．3．1 疫苗应包装良好，2～8℃冷藏运输，冬季运输要注意防冻。
3．3．2 疫苗应在2～8℃避光保存。
3．3．3 疫苗的运输和保存应有完善的管理制度。
3．3．4 疫苗的入库和发放必须做好记录。
3．3．5 每批次疫苗应留样。
4 疫苗使用要求
4．1 家禽要求
待接种的家禽必须临床表现健康。
4．2 疫苗检查
疫苗使用前要仔细核对疫苗的抗原亚型，详细记录生产厂家、生产批号和失效日期。出现包装破损、破乳分层、颜色改变、异物、发霉等现象的疫苗不得使用。
4．3 疫苗预温
疫苗使用前应提至室温，使用时应充分摇匀。疫苗启封后，应于24h内用完。
4．4 接种器械
注射器具应无菌，针头以9～12号为宜，使用过程中应注意消毒，勤换针头。
4．5 接种部位
颈部背侧下三分之一处进行皮下注射，针头向下与皮肤呈45度角，确保注入颈部皮下；种禽、产蛋禽可选用胸部肌肉注射。
4．6 疫苗接种过程的质量监控
4．6．1 专人负责监督接种过程，确保每只家禽都被接种，发现漏种的家禽要及时补种。
4．6．2 做好免疫记录，记录内容包括：畜主、家禽的品种、数量、日龄、疫苗生产厂家、类型、批次，接种的时间和剂量等。
5 推荐的免疫程序
5．1 生产蛋鸡和种鸡
雏鸡在2周龄首次免疫，接种剂量0．3mL；5周龄时加强免疫，接种剂量0．5mL；120日龄左右再加强免疫，接种剂量0．5mL；以后间隔5个月加强免疫一次，接种剂量0．5mL；种鸡24周龄加强免疫一次，接种剂量0．5mL。
5．2 肉仔鸡
雏鸡在5～10日龄免疫，接种剂量0．3mL。
5．3 100日龄左右出栏的肉鸡
雏鸡在2周龄首次免疫，接种剂量为0．3mL；5周龄时加强免疫，接种剂量0．5mL。
5．4 鸭和鹅
在1～2周龄首免，接种剂量为0．5mL；4～5周龄时加强免疫，接种剂量1．0mL；以后间隔4个月加强免疫一次，鸭接种剂量1．0mL，鹅接种剂量1．5mL。
5．5 紧急免疫接种
发生疫情时，免疫接种应先从安全区域到受威胁区、最后到疫区。
6 免疫效果监测
6．1 在疫苗免疫后4周，每群禽抽样30只，静脉采血，分离血清，按GB／T 18936血凝抑制试验（HI）检测禽血清HI的抗体水平。70％被免疫鸡只的HI抗体水平大于或者等于4log（2 上标）时，判定为合格。
6．2 各级动物防疫监督机构应对家禽免疫效果进行监测，并指导免疫工作。
6．3 免疫效果监测应建立记录档案。
新城疫免疫技术规范
1 范围
本规范规定了新城疫疫苗的运输、贮存、使用、免疫程序和免疫效果评价的技术要求。
本规范适用于Ⅱ系、Ⅳ系等新城疫活疫苗、新城疫低毒力灭活疫苗的免疫。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本规范。
2．1 批次
具有相同代码、组成均一的全部疫苗。
2．2 剂量
标签上标定的特定年龄动物，经特定免疫途径，每羽一次接种的疫苗使用量。
2．3 效力
使用生物制品所产生的特异免疫保护能力。
3 疫苗的选用和贮运
3．1 根据预防新城疫需要，选择低毒力灭活疫苗和／或ICPI≦0．4的弱毒疫苗用于禽的预防接种。
3．2 疫苗运输和贮存
3．2．1 冻干疫苗在运输过程中，必须放在冷藏容器内，严禁阳光照射和接触高温，按疫苗保存要求进行贮存。油乳剂灭活疫苗在2～8℃下运输和保存，切勿冻结。
3．2．2 疫苗的入库和发放必须做好记录。
3．2．3 每批次疫苗应留样。
4 疫苗使用要求
4．1 对接种禽的要求
待接种的禽必须临床表现健康。
4．2 疫苗检查
4．2．1 疫苗使用前要仔细检查外包装是否完好，标签是否完整，包括疫苗名称、生产批号、批准文号、有效期、生产厂家等。
4．2．2 瓶盖松动、疫苗瓶裂损、失真空、色泽与说明不相符、瓶内有异物、发霉或超过有效期等疫苗不得使用。
4．3 疫苗稀释
活疫苗按瓶签注明的羽份，用生理盐水稀释，必须在2h内用完。
4．4 接种方法要求
4．4．1 冻干疫苗可采用滴鼻、点眼、喷雾或饮水免疫，其稀释液及免疫剂量按疫苗使用说明进行。
油乳剂灭活疫苗接种途径和剂量按疫苗使用说明进行。
4．4．2 滴管、针头等接种用具，使用前后须严格消毒；接种后剩余的疫苗、空瓶、稀释液及敷料等应做消毒或无害化处理。
4．4．3 饮水免疫前要控制断水时间，忌用金属容器，所用的水不得含有游离氯或其他消毒剂，水量适中，保证禽群在2h内饮完。
4．4．4 油乳剂灭活疫苗使用前先升至室温并充分摇匀，启封后当日用完。
4．5 疫苗接种过程的质量监控
4．5．1 专人负责监督接种过程，确保每只家禽按要求接种，漏免的要及时补免。
4．5．2 做好记录，内容包括：畜主，家禽的品种、数量、日龄，疫苗生产厂家、批次，接种方法、剂量和时间等。
5 推荐的免疫程序
5．1 种鸡 7～10日龄弱毒苗滴鼻、点眼，同时用油乳剂灭活苗免疫一次；6～7周龄弱毒苗喷雾或饮水免疫；120日龄左右油乳剂灭活苗免疫；280～300日龄油乳剂灭活苗或弱毒疫苗再免疫一次。
5．2 商品蛋鸡 7～10日龄弱毒苗滴鼻、点眼，同时用油乳剂灭活苗免疫一次；6～7周龄弱毒苗喷雾或饮水免疫，同时用油乳剂灭活苗免疫；120日龄左右油乳剂灭活苗免疫。
5．3 商品肉鸡 7～10日龄弱毒苗滴鼻、点眼，同时用油乳剂灭活苗免疫；18～20日龄弱毒苗饮水免疫。
6 免疫效果监测
6．1 免疫接种后2～3周，每群鸡抽样30只按新城疫诊断技术规范中的血凝抑制（HI）进行抗体监测，70％被免疫鸡只的抗体水平大于等于4log（2 上标）时，判定为免疫合格。
6．2 各级动物防疫监督机构应对鸡免疫效果进行监测，并指导免疫工作。
6．3 免疫效果监测应建立记录档案。
猪瘟免疫技术规范
1 范围
本规范规定了猪瘟弱毒疫苗的运输、贮存、使用、免疫程序和免疫效果评价的技术要求。
本规范适用于猪瘟弱毒疫苗的免疫。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本规范。
2．1 批次
具有相同代码、组成均一的全部疫苗。
2．2 剂量
标签上标定的特定年龄动物，经特定免疫途径，每头猪一次接种的疫苗量。
2．3 效力
使用生物制品所产生的特异的免疫保护能力。
3 疫苗的选择和贮运
3．1 选择猪瘟弱毒疫苗用于预防接种。
3．2 疫苗的运输和贮存
3．2．1 疫苗应采用8℃以下冷藏条件运输。
3．2．2 疫苗应按要求保存。
3．2．3 做好疫苗的入库和发放记录。
3．2．4 每批次疫苗应留样。
4 疫苗使用要求
4．1 对猪的要求
4．1．1 待接种的猪临床观察健康，凡有病、体弱的猪不宜接种，患病猪待康复后再按规定接种，怀孕猪的免疫应严格按说明书要求进行。
4．2 疫苗检查
4．2．1 疫苗使用前要仔细检查外包装是否完好，标签是否完整，包括疫苗名称、生产批号、批准文号、有效期、生产厂家等。
4．2．2 瓶盖松动、疫苗瓶裂损、失真空、超过有效期、疫苗色泽与说明不相符，或瓶内有异物等疫苗不能使用。
4．3 接种器具要求
4．3．1 建议使用9～12号针头。
4．3．2 注射器和针头应洁净无菌。
4．4 接种安全
4．4．1 发生疫情时，免疫接种应先从安全区域到受威胁区、最后到疫区。
4．4．2 首次使用本疫苗的地区，建议应选择一定数量家畜进行小范围试用，观察7～10d，临床无不良反应后，方可扩大接种面。
4．5 接种操作
4．5．1 注射部位用75％酒精棉或碘酊擦拭消毒，再用挤干的酒精棉擦干消毒部位。
4．5．2 瓶塞上应固定一只消毒过的针头，其上面覆盖酒精棉球。
4．5．3 选择在耳根后肌肉注射，注射时要保持针头指向后方，以保证避开耳道，针头与皮肤表面呈45度角，避免疫苗流出。吸出的疫苗液不可回注于瓶内，针筒排气溢出的疫苗液应吸积于酒精棉球上，并将其收集于专用瓶内，用过的酒精棉球、碘酊棉放置入专用瓶内，与疫苗瓶一同进行无害化处理。
4．5．4 疫苗稀释后，应放在冷藏容器内，严禁冻结。如环境温度在15℃以下，应6h内用完。如环境温度在15～27℃，应3h内用完。
4．5．5 疫苗使用的稀释液及注射剂量按疫苗使用说明进行。
4．5．6 一支注射器在使用中只能用于一种疫苗的接种，接种时针头要逐头更换。
5 推荐免疫程序
仔猪20～30日龄接种猪瘟疫苗，60日龄左右再接种1次；或采取超前免疫，即出生时立即接种1次疫苗，2h后再喂初乳，35日龄左右接种第2次，70日龄左右接种第3次；种54母猪配种前10～15d接种1次，种公猪春秋季各接种1次疫苗。
6 免疫效果监测
6．1 免疫接种后，按猪瘟诊断技术规范的规定进行免疫抗体监测，当抗体保护水平低下时，应当进行疫苗接种。
6．2 各级动物防疫监督机构应对猪免疫效果进行监测，并指导免疫工作。
6．3 免疫效果监测应建立记录档案。
样品采集、保存及运输技术规范
1 范围
本规范规定了动物疫病诊断、监测样品的采集、保存和运送的技术要求。
本规范适用于动物疫病诊断、监测样品的采集、保存和运送。
2 样品采集所遵循的一般原则及采样前的准备
2．1 样品采集的一般原则
2．1．1 凡发现怀疑炭疽等不宜解剖的患畜，严禁剖检。
2．1．2 采取病料的种类，根据不同的疫病或检验目的，采其相应的血样、活体组织、脏器、肠内容物、分泌物、排泄物或其它材料；进行流行病学调查、抗体检测、动物群体健康评估或环境卫生检测时，样品的数量应满足统计学的要求。在无法确认病因时，应系统采集病料。
2．1．3 内脏病料的采取，如患畜已死亡，应尽快采集，最迟不超过6h。
2．1．4 采样时应考虑动物福利，并作好人身防护，严防人畜共患病感染。
2．2 采样前的准备
2．2．1 采样人员必须是兽医技术人员，熟悉采样器具的使用，掌握正确采样方法。
2．2．2 器具
2．2．2．1 动物检疫器械箱，保温箱或保温瓶，解剖刀，剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉，碘酒棉，注射器及针头等。
2．2．2．2 样品容器（小瓶、平皿、离心管及易封口样品袋、塑料包装袋等）。
2．2．2．3 试管架，铝盒，瓶塞，无菌棉拭子，胶布，封口膜，封条，冰袋等。
2．2．2．4 记录和防护材料
不干胶标签、签字笔、圆珠笔、记号笔、采样单、记录本等；口罩、一次性手套、乳胶手套、防护服、防护帽、胶靴等。
2．2．2．5 采样刀剪等器具和样品容器须无菌。
2．2．3 试剂
配制方法见附录A。
3 样品采集
3．1 血液
3．1．1 采血部位
大哺乳动物可选用颈静脉或尾静脉采血，也可采胫外静脉或乳房静脉血液。毛皮动物少量采血可穿刺耳尖或耳壳外侧静脉，多量采血可在隐静脉采集，也可用尖刀划破趾垫至一定深度或剪断尾尖部采血。啮齿类动物可从尾尖采血，也可由眼窝内的血管丛采血；兔可从耳背静脉、颈静脉或心脏采血。禽类通常选用翅静脉采血，也可通过心脏采血。
3．1．2 采血方法
对动物采血部位的皮肤先剃毛（拔毛），75％酒精消毒，待干燥后采血，采血可用针管、针头、真空管或用三棱针穿刺，将血液滴到或抽入试管内。禽类等少量血清样品的采集，可用塑料管采集。
3．1．3 血样种类
3．1．3．1 全血样品
进行血液学分析，细菌、病毒或原虫培养，通常用全血样品。样品中加抗凝剂。抗凝剂可用0．1％肝素、阿氏液（阿氏液为红血球保存液，使用时1份血液加2份阿氏液）或2％柠檬酸钠。采血时应直接将血液滴入抗凝剂中，并立即连续、缓慢摇动，充分混合。也可将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶内，震荡，脱纤维蛋白抗凝。
3．1．3．2 血清样品
用作血清样品的血液不加抗凝剂，血液在室温下静置至血液凝固，收集析出的血清。必要时，经低速离心分离血清。在不影响检测结果的原则下，可根据需要加入适宜的防腐剂。做病毒中和试验的血清避免使用化学防腐剂。如需长时间保存，则将血清置-20℃以下保存，但要尽量避免反复冻融。
3．1．3．3 血浆样品
采血试管内先加上抗凝剂，加入血液后，使血液与抗凝剂充分混合，然后静止，待细胞下沉后，上层即为血浆。
3．2 一般组织
3．2．1 采样方法
用常规解剖器械剥离样本动物的皮肤，体腔用消毒的器械剥开，所需病料按无菌操作方法采集病料。剖开腹腔时，注意不要损坏肠道。
进行细菌、病毒、原虫等病原分离所用组织块的采集，可用一套新消毒的器械切取所需器官的组织块，每个组织块应单独放在已消毒的容器内。
3．2．2 组织样品种类
3．2．2．1 病原分离样品的采集
用于微生物学检验的病料应新鲜，尽可能减少污染。用于细菌分离样品的采集，首先以烧红的刀片烫烙脏器表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂金耳伸入孔内，取少量组织或液体，作涂片镜检或划线接种于适宜的培养基上。
3．2．2．2 组织病理学检查样品的采集
采集包括病灶及临近正常组织的组织块，立即放入10倍于组织块的10％福尔马林溶液中固定。组织块厚度不超过0．5cm，切成1～2平方米（检查狂犬病则需要较大的组织块）。组织块切忌挤压、刮摸和水洗。冷冻切片样品，应将组织块放在0～4℃容器中，尽快送实验室检验。
3．3 肠道组织、内容物或粪便
选择病变最明显的肠道部分，通过灭菌生理盐水冲洗弃去其中的内容物，取肠道组织；取肠内容物时，烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取内容物放入盛有灭菌的30％甘油磷酸缓冲盐水保存液中送检，或将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断送检。根据需要，粪便样品也可直接从饲养场所采集。
3．4 胃液及瘤胃内容物
3．4．1 胃液采集
胃液可用多孔胃管抽取，将胃管送入胃内，其外露端接在吸引器的负压瓶上，加压后，胃液即可自动流出。
3．4．2 瘤胃内容物采集
反刍动物反刍时，当食团从食道逆入口腔，立即打开口腔，用一只手拉住舌头，另一只手伸入口腔即可取出少量瘤胃内容物。
3．5 拭子样品
3．5．1 呼吸道拭子
应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或气管内的分泌物，蘸取分泌物后立即将拭子浸入保存液中，密封，低温保存。常用的保存液有pH7．4的含抗生素的PBS 保存液、pH7．2～7．4的灭菌肉汤或30％甘油盐水缓冲液，如准备将待检标本接种组织培养，则保存于含0．5％乳蛋白水解液中。一般每支拭子需保存液1mL。
3．5．2 肛门或泄殖腔拭子
将灭菌的棉拭子插入肛门或泄殖腔内采集其内容物和分泌物后，立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。一般每支拭子需保存液1mL。
3．5．3 生殖道拭子
用灭菌的棉拭子采集生殖道分泌物或采集阴道或包皮冲洗液。
3．5．4 眼睛拭子
眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后放在灭菌的30％甘油盐水缓冲保存液中送检。有时也采取病变组织碎屑，置载玻片上，供显微镜检查。
3．6 皮肤
病料直接采自病变部位，如病变皮肤的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。
3．7 胎儿
将流产后的整个胎儿，用塑料薄膜、油布或数层不透水的油纸包紧，装入容器内，立即送往实验室。
3．8 家畜及家禽
将整个尸体包入不透水塑料薄膜、或油布中，装入容器内，送往实验室。
3．9 骨
需要完整的骨标本时，应将附着的肌肉和韧带等全部除去，表面撒上食盐，然后包入浸过5％石炭酸溶液的纱布中，装入不漏水的容器中送往实验室。
3．10 脑、脊髓
3．10．1 脑、脊髓的采集
如采集脑、脊髓做病毒检查，可将脑、脊髓浸入30％甘油盐水缓冲液中或将整个头部割下，包入浸过消毒液的纱布中，置于不漏水的容器内送往实验室。
3．10．2 脑、脊髓液的采集
3．10．2．1 采样前的准备
采样使用特制的专用穿刺针，或用长的封闭针头（将针头稍磨钝，并配以合适的针芯）；采样前，术部及用具均按常规消毒。
3．10．2．2 采样方法
1） 颈椎穿刺法：穿刺点为环枢孔。将动物实施站立或横卧保定，使其头部向前下方屈曲，术部经剪毛消毒，穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入。将针体刺入蛛网膜下腔，立即拔出针芯，脑脊髓液自动流出或点滴状流出，盛入消毒容器内。
2） 腰椎穿刺法：穿刺部位为腰荐孔。实施站立保定，术部剪毛消毒后，用专用的穿刺针刺入，当刺入蛛网膜下腔时，即有脑脊髓液滴出或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器内。
3．10．2．3 采样数量
大型动物颈部穿刺一次采集量35～70mL，腰椎穿刺一次采集量15～30mL。
3．11 液体样本
3．11．1 胆汁、脓、粘液或关节液
采集胆汁、脓、粘液或关节液等样品时，用烫烙法消毒采样部位，用灭菌吸管、毛细吸管或注射器经烫烙部位插入，吸取内部液体材料，然后将材料注入灭菌试管中，塞好棉塞送检。也可用接种环经消毒部位插入，提取病料直接接种在培养基上。
供显微镜检查的脓、血液及粘液抹片的制备方法：将材料置玻片上，用一灭菌玻棒均匀涂抹或另用一玻片推抹。组织块、致密结节及脓汁等亦可放在两张玻片中间，然后沿水平面向两端推移。用组织块作触片时，持小镊将组织块的游离面在玻片上轻轻涂抹即可。
3．11．2 乳汁
用消毒药水洗净乳房（取乳者的手亦应事先消毒），并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的3～4 把乳汁弃去，然后采集10mL左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。
3．11．3 精液
精液样品用人工方法采集，所采样品应包括“富精”部分，并避免加入防腐剂。
3．11．4 尿液
动物排尿时，用洁净的容器直接接取。也可用塑料袋固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液。尿液采取宜早晨进行。
3．12 环境
为监测环境卫生或调查疾病，可从遗弃物、通风管、下水道、孵化场或屠宰场采集有代表性样品。
4 送检样品的记录和包装
4．1 采样单及标签等的填写
采样单应用钢笔或签字笔逐项填写（一式三份），样品标签和封条应用圆珠笔填写，保温容器外封条应用钢笔或签字笔填写，小塑料离心管上可用记号笔作标记。应将采样单和病史资料装在塑料包装袋中，随样品一起送到实验室。样品信息至少应包括以下内容：
（1）畜主姓名和畜禽场地址；
（2）畜禽（农）场里饲养动物品种及数量；
（3）被感染动物或易感动物种类；
（4）首发病例和继发病例的日期及造成的损失；
（5）感染动物在畜禽群中的分布情况；
（6）死亡动物数、出现临床症状的动物数量及年龄；
（7）临床症状及其持续时间，包括口腔、眼睛和腿部情况，产奶或产蛋记录，死亡情况和时间，免疫和用药情况等；
（8）饲养类型和标准，包括饲料种类；
（9）送检样品清单和说明，包括病料种类、保存方法等；
（10）动物治疗史；
（11）要求做何种试验；
（12）送检者的姓名、地址、邮编和电话；
（14）送检日期；
（115）采样人和被采样单位签章。
4．2 包装要求
4．2．1 每个组织样品应仔细分别包装，在样品袋或平皿外贴上标签，标签注明样品名、样品编号、采样日期等。再将各个样品放到塑料包装袋中。
4．2．2 拭子样品小塑料离心管应放在特定塑料盒内。
4．2．3 血清样品装于小瓶时应用铝盒盛放，盒内加填塞物避免小瓶晃动，若装于小塑料离心管中，则应置于塑料盒内。
4．2．4 包装袋外、塑料盒及铝盒应贴封条，封条上应有采样人签章，并注明贴封日期，标注放置方向。
5 保存和运输
5．1 样品应置于保温容器中运输，保温容器应密封，防止渗漏。一般使用保温箱或保温瓶，保温容器外贴封条，封条有贴封人（单位）签字（盖章），并注明贴封日期。
5．2 样品应在特定的温度下运输，拭子样品和组织样品可以暂时冷藏处理，然后立即运送实验室。
5．3 各种样品到达实验室后，应按有关规定冷藏或冷冻保存。长期保存的样品应超低温冷冻（以-70℃或以下为宜）保存，尽量避免反复冻融。
附录A
（规范性附录）
待检样品保存液的配制
A．1 阿氏液（Alsevers）
葡萄糖 2．05g
柠檬酸钠（Na（3 下标）C（6 下标）H（5 下标）O（7 下标）·2H（2 下标）O） 0．80g
柠檬酸 0．055g
氯化钠 0．42g
加蒸馏水至100mL，溶解后调pH至6．1 后分装，70kPa 15min灭菌，冷却后4℃冰箱中保存备用。
A．2 30％甘油盐水缓冲液
甘油 30mL
氯化钠（NaCl） 4．2g
磷酸二氢钾（KH（2 下标）PO（4 下标）） 1．0g
磷酸氢二钾（K（2 下标）HPO（4 小标）） 3．1g
0．02％酚红 1．5mL
蒸馏水（或无离子水） 加至100mL
加热溶化，校正pH值为7．6，100kPa 15min灭菌，冷却后4℃冰箱中保存备用。
A．3 肉汤
牛肉膏 3．5g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
充分混合后，加热溶解，校正pH值为7．2～7．4，用流通蒸气加热30min，滤纸过滤，分装于试管或烧瓶中，以100kPa 20min灭菌，冷却后4℃冰箱中保存备用。
A．4 pH7．4 的等渗磷酸盐缓冲液（ PBS ）
氯化钠（NaCl） 8．0g
磷酸二氢钾（KH（2 下标）PO（4 下标）） 0．2g
磷酸氢二钠（Na（2 下标）HPO（4 下标）·12H（2 下标）O） 2．9g
氯化钾（KCl） 0．2g
将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至1000mL，调pH值至7．4，高压消毒灭菌112Kpa 20min，冷却后，保存于4℃冰箱中备用。
A．5 棉拭子用抗生素PBS（病毒保存液）的配制
取上述PBS液，按要求加入下列抗生素：喉气管拭子用PBS液中加入青霉素（2000IU／mL）、链霉素（2mg／mL）、丁胺卡那霉素（1 000IU／mL）、制霉菌素（1 000IU／mL）。粪便和泄殖腔拭子所用PBS中抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后应调pH值至7．4。采样前分装小塑料离心管，每管中加PBS 1．0～1．3mL，采粪便时在西林瓶中加PBS 1．0～1．5mL，采样前冷冻保存。
口蹄疫诊断技术规范
1 范围
本规范规定了口蹄疫（FMD）采样、临床及病理学诊断和实验室检验的方法和技术要求。
本规范适用于口蹄疫的诊断与监测。
2 样品采集、保存和运送
2．1 样品的采集和保存
2．1．1 组织样品
2．1．1．1 样品的选择
用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物（牛、羊或猪）未破裂或刚破裂的水泡皮和水泡液为宜。对临床健康但怀疑带毒的动物可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。
2．1．1．2 样品的采集和保存
样品采集部位可用清水清洗（切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭），剪取病畜的新鲜水泡皮3～5g放入灭菌小瓶中，加适量50％甘油磷酸盐缓冲液（pH7．4），加盖密封；也可采用无菌器具采集水泡液，装入灭菌小瓶中（可加适量抗菌素），加盖密封，冷冻保存。
2．1．1．3 在无法采集水泡皮和水泡液时，可采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品，装入洁净的小瓶内，加盖密封，冷冻保存。
2．1．2 牛、羊食道-咽部分泌物（O-P液）样品
2．1．2．1 样品采集
采样探杯在使用前经0．2％柠檬酸或2％氢氧化钠浸泡5min，再用洁净水冲洗。每采完一头动物，探杯要进行消毒并充分清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。
2．1．2．2 样品的保存
将采集到的8～10mLO-P液倒入灭菌容器中，容器中应事先加有8～10mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液（0．04mol／L、pH7．4），密封后充分摇匀，冷冻保存。
2．1．3 血清
采集动物血液，每头不少于5mL。无菌分离血清装入灭菌小瓶中，加盖密封后冷藏或冷冻保存。
2．2 采样记录及标签
样品的包装瓶上均要贴上标签，标明编号，并填写采样单。
2．3 样品运送
运输时样品容器与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴生物安全警示标志。
3 诊断标准
3．1 诊断指标
3．1．1 临床指标
牛、羊、猪在临床上具有诊断意义的特异性症状为口、鼻、蹄、乳头等部位出现水泡。
3．1．2 病原学检测指标
采集的新鲜水泡皮、水泡液或其它组织样品，经双抗体夹心酶联免疫吸附试验（见4．1）、反向间接血凝试验（见4．2）、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）（见4．3）、乳鼠中和试验（见4．4）或微量补体结合试验（见4．5）进行病原检测。检测结果为阴性时，需将样品接种3～5日龄乳鼠或细胞盲传2 代进行病毒增殖，用乳鼠组织或细胞培养物再进行上述检测。
O-P液可直接用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法进行检测，或经乳鼠或敏感细胞增殖后用上述方法进行病原检测。
3．1．3 血清检测
将采集的血清样品，用非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验（见4．6）检测野毒感染抗体，或用液相阻断-酶联免疫吸附试验（见4．7）、病毒感染相关抗原（VIA）检测试验（见4．8）进行抗体检测。
3．2 结果判定
3．2．1 疑似口蹄疫
符合临床典型症状指标。
3．2．2 确诊口蹄疫
3．2．2．1 经实验室病原检测呈阳性的；
3．2．2．2 非结构蛋白抗体阳性，或未免疫畜群病毒抗体阳性。
4 实验室诊断方法
4．1 双抗体夹心酶联免疫吸附试验
4．1．1 样品处理
将采集的水泡皮等动物组织样品，剪碎研磨，加0．04mol／L PBS（pH7．4）制成1：5 的悬液。置室温（20℃左右）2h以上，或4℃冰箱过夜。3000r／min离心10min，取上清液作为检测材料。样品量不足的，可将几个样品合并成一个样品检测。
4．1．2 主要试剂
4．1．2．1 抗体
包被抗体：兔抗FMDV-“O”、“A”、“Asia-Ⅰ”型146S 血清；兔抗SVDV-160S 血清检测抗体：豚鼠抗FMDV-“O”、“A”、“Asia-Ⅰ”型146S 血清；豚鼠抗SVDV-160S 血清。
4．1．2．2 酶结合物
兔抗豚鼠Ig 抗体（Ig）-辣根过氧化物酶（HRP）结合物。
4．1．2．3 对照抗原
灭活的FMDV-“O”“A”“Asia-Ⅰ”各型及SVDV细胞病毒液。
4．1．2．4 底物溶液（底物／显色剂）
3％过氧化氢／3．3mmol／L 邻苯二胺（OPD）。
4．1．2．5 终止液
1．25mol／L 硫酸。
4．1．2．6 缓冲液
包被缓冲液 0．05mol／L Na（2 下标）CO（3 下标）-NaHCO（3 下标），pH9．6
稀释液A 0．01mol／L PBS - 0．05％（v／v）Tween-20，pH7．2～7．4
稀释液B 5％脱脂奶粉（w／v）- 稀释液A
洗涤缓冲液 0．002mol／L PBS - 0．01％（v／v）Tween-20
4．1．3 主要器材设备
4．1．3．1 固相
96孔平底聚苯乙烯ELISA 专用板。
4．1．3．2 移液器、吸头及贮液槽
微量可调移液器一套，可调范围0．5～5000μL（5～6支）；多（4、8、12）孔道微量可调移液器（25～250μL）；微量可调连续加样移液器（10～100μL）；与各移液器匹配的各种吸头，及配套使用的贮液槽。
4．1．3．3 振荡器
与96孔微量板配套的旋转振荡器。
4．1．3．4 酶标仪，492nm波长滤光片。
4．1．3．5 洗板机或洗涤瓶，吸水纸巾。
4．1．3．6 37℃恒温温室或温箱。
4．1．4 实验方法
4．1．4．1 包被固相
FMDV 各血清型及SVDV 兔抗血清分别用包被缓冲液稀释至工作浓度，然后按表1＜Ⅰ＞所示布局加入微量板各行，每孔50μL，加盖后37℃振荡2h，或室温（20℃左右）振荡30min，然后置湿盒中4℃过夜（可以保存1周左右）。
表1 定型ELISA 微量板包被血清布局＜Ⅰ＞ 、对照和被检样品布局＜Ⅱ＞
<Ⅰ> <Ⅱ> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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┃ A FMDV“O” ┃C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S1 1 ┃ S3 3 ┃ S5 5 ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ B “A” ┃C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S1 1 ┃ S3 3 ┃ S5 5 ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ C “Asia-Ⅰ” ┃C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S1 1 ┃ S3 3 ┃ S5 5 ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ D SVDV ┃ C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S1 1 ┃ S3 3 ┃ S5 5 ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ E FMDV“O” ┃C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S2 2 ┃ S4 4 ┃ S6 6 ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ F “A” ┃C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S2 2 ┃ S4 4 ┃ S6 6 ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ G “Asia-Ⅰ” ┃C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S2 2 ┃ S4 4 ┃ S6 6 ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━┫
┃ H SVDV ┃ C++C++ ┃C+ C+ ┃C- C- ┃S2 2 ┃ S4 4 ┃ S6 6 ┃
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牛病料需要进行 “O”、“A”和“Asia-Ⅰ”型的鉴定；猪病料还要进行猪水泡病病原（SVDV）鉴别鉴定。
试验开始，依据当天检测样品的数量包被，或取出包被好的板子；如用可拆卸微量板，则根据需要取出几条。在试验台上放置20min，再洗涤5次，扣干。
4．1．4．2 加对照抗原和待检样品
（1）布局：空白和各阳性对照、待检样品在ELISA板上的分布位置如表1＜Ⅱ＞所示。
（2）加样：①第5和第6列为空白对照（C-），每孔加50μL 稀释液A。②先将各型阳性对照抗原分别以稀释液A适当稀释，然后加入与包被抗体同型的各行孔中，C＋＋为强阳性，C＋为阳性，可以用同一对照抗原的不同稀释度。每一对照2孔，每孔50μL。③按待检样品的序号（S1、S2 ．．．）逐个加入，每份样品每个血清型加2孔，每孔50μL。37℃振荡1h，洗涤5次，扣干。
4．1．4．3 加检测抗体 各血清型豚鼠抗血清以稀释液A 稀释至工作浓度，然后加入与包被抗体同型各行孔中，每孔50μL。37℃振荡1h。洗涤5次，扣干。
4．1．4．4 加酶结合物 酶结合物以稀释液B 稀释至工作浓度，每孔50μL。37℃振荡40min。洗涤5次，扣干。
4．1．4．5 加底物溶液 试验开始时，按当天需要量从冰箱暗盒中取出OPD，放在温箱中融化并使之升温至37℃。临加样前，按每6mLOPD加3％双氧水30μL（一块微量板用量），混匀后每孔加50μL。37℃振荡15min。
4．1．4．6 加终止液 显色反应15min，每孔加50μL 终止液1．25mol／L H（2 下标）SO（4 下标）。
4．1．4．7 观察和判读结果
终止反应后，先用肉眼观察全部反应孔。如空白对照和阳性对照孔的显色基本正常，再用酶标仪（492nm）判读OD值。
4．1．5 结果判定
4．1．5．1 数据计算
为了便于说明，假设表3所列数据为检测结果（OD值）。利用表2 所列数据，计算平均OD值和平均修正OD值（表3）
（1）各行2孔空白对照（C-）平均OD值；
（2）各行（各血清型）抗原对照（C＋＋、C＋）平均OD值；
（3）各待检样品各血清型（2孔）平均OD值；
（4）计算出各平均修正OD值（＝[每个（2）或（3）值]－[同一行的（1）值]。
表2 定型ELISA结果（OD值）
C++ C+ C- S1 S2 S3
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┃ AFMDV“O” ┃1．84 1．74 ┃ 0．56 0．46 ┃ 0．06 0．04 ┃ 1．62 1．54 ┃ 0．68 0．72 ┃ 0．10 0．08 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ B “A” ┃1．25 1．45 ┃ 0．40 0．42 ┃ 0．07 0．05 ┃ 0．09 0．07 ┃ 1．22 1．32 ┃ 0．09 0．09 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃C“Asia-Ⅰ”┃1-32 1．12 ┃ 0．52 0．50 ┃ 0．04 0．08 ┃ 0．05 0．09 ┃ 0．12 0．06 ┃ 0．07 0．09 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ D SVDV ┃ 1．08 1．10 ┃ 0．22 0．24 ┃ 0．08 0．08 ┃ 0．09 0．10 ┃ 0．08 0．12 ┃ 0．28 0．34 ┃
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C++ C+ C- S4 S5 S6
┏━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┓
┃ EFMDV“O” ┃0．94 0．84 ┃ 0．24 0．22 ┃ 0．06 0．06 ┃ 1．22 1．12 ┃ 0．09 0．10 ┃ 0．13 0．17 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ F “A” ┃1．10 1．02 ┃ 0．11 0．13 ┃ 0．06 0．04 ┃ 0．10 0．10 ┃ 0．28 0．26 ┃ 0．20 0．28 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃G“Asia-Ⅰ”┃0．39 0．41 ┃ 0．29 0．21 ┃ 0．09 0．09 ┃ 0．10 0．09 ┃ 0．10 0．10 ┃ 0．35 0．33 ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ H SVDV ┃ 0．88 0．78 ┃ 0．15 0．1l ┃ 0．05 0．05 ┃ 0．11 0．07 ┃ 0．09 0．09 ┃ 0．10 0．12 ┃
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表3 平均OD值／平均修正OD值
C++ C+ C- S1 S2 S3
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┃ A FMDV“O” ┃ 1．79／1．75 ┃ 0．51／0．46 ┃ 0．05 ┃ 1．58／1．53 ┃ 0．70／0．65 ┃ 0．09／0．04 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ B “A” ┃ 1．35／1．29 ┃ 0．41／0．35 ┃ 0．06 ┃ 0．08／0．02 ┃ 1．27／1．21 ┃ 0．09／0．03 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ C“Asia-Ⅰ” ┃ 1．22／1．16 ┃ 0．51／0．45 ┃ 0．06 ┃ 0．07／0．03 ┃ 0．09／0．03 ┃ 0．08／0．02 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ D SVDV ┃ 1．09／1．01 ┃ 0．23／0．15 ┃ 0．08 ┃ 0．10／0．02 ┃ 0．10／0．02 ┃ 0．31／0．23 ┃
┗━━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━┛
C++ C+ C- S4 S5 S6
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┃ E FMDV“O” ┃ 0．89／0．83 ┃ 0．23／0．17 ┃ 0．06 ┃ 1．17／1．11 ┃ 0．10／0．04 ┃ 0．15／0．09 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ F “A” ┃ 1．06／1．01 ┃ 0．12／0．07 ┃ 0．05 ┃ 0．10／0．05 ┃ 0．27／0．22 ┃ 0．24／0．19 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ G“Asia-Ⅰ” ┃ 0．40／0．31 ┃ 0．25／0．16 ┃ 0．09 ┃ 0．10／0．01 ┃ 0．10／0．01 ┃ 0．34／0．25 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ H SVDV ┃ 0．83／0．78 ┃ 0．13／0．08 ┃ 0．05 ┃ 0．09／0．05 ┃ 0．09／0．04 ┃ 0．11／0．06 ┃
┗━━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━┛
4．1．5．2 结果判定
（1）试验不成立
如果空白对照（C-）平均OD值＞0．10，则试验不成立，本试验结果无效。
（2）试验基本成立
如果空白对照（C-）平均OD值≤0．10，则试验基本成立。
（3）试验成立
如果空白对照（C-）平均OD值≤0．10，C＋平均修正OD值＞0．10，C＋＋平均修正OD值＞1．00， 试验成立。如表2中A、B、C、D行所列数据。
① 如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≤0．10，则该血清型为阴性。如S1 的“A”、“Asia-Ⅰ”型和“SVDV”；
② 如果某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0．10，而且比其它型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。如S1为“O”型；S3为“Asia-Ⅰ”型；
③ 虽然某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0．10，但不大于其它型的平均修正OD值的2倍，则该样品只能判定为可疑。该样品应接种乳鼠或细胞，并盲传数代增毒后再作检测。如S2“A”型。
（4）试验部分成立
如果空白对照（C-）平均OD值≤0．10，C＋平均修正OD值≤0．10，C＋＋平均修正OD值≤1．00， 试验部分成立。如表2中E、F、G、H行所列数据。
① 如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≥0．10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。例如S4 判定为“O”型。
② 如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0．10～1．00 之间，而且比其它型的平均修正OD值大2倍或以上，该样品可以判定为该最高OD值所在血清型。例如S5 判定为“A”型。
③ 如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0．10～1．00 之间，但不比其它型的平均修正OD值大2倍，该样品应增毒后重检。如S6“Asia-Ⅰ”型。
4．2 反向间接血凝试验（RIHA）
4．2．1 材料准备
4．2．1．1 96孔微型聚乙烯血凝滴定板（110度），微量振荡器或微型混合器， 25μL、50μL 稀释用滴管、乳胶吸头或25μL、50μL移液加样器。
4．2．1．2 pH7．6、0．05mol／L 磷酸缓冲液（pH7．6、0．05mol／L PB），pH7．6、50％丙三醇磷酸缓冲液（GPB），pH7．2、0．11mol／L 磷酸缓冲液（pH7．2、0．11mol／L PB），配制方法见 GB／T19200-2003《猪水泡病诊断技术》附录A（规范性附录）。
4．2．1．3 稀释液Ⅰ、稀释液Ⅱ，配制方法见GB／T 19200-2003《猪水泡病诊断技术》附录B（规范性附录）。
4．2．1．4 标准抗原、阳性血清，由指定单位提供，按说明书使用和保存。
4．2．1．5 敏化红细胞诊断液：由指定单位提供，效价滴定见GB／T 19200-2003《猪水泡病诊断技术》附录C（规范性附录）。
4．2．1．6 被检材料处理方法见GB／T 19200-2003《猪水泡病诊断技术》附录E（规范性附录）。
4．2．2 操作方法
4．2．2．1 使用标准抗原进行口蹄疫A、O、C、Asia-Ⅰ型及与猪水泡病鉴别诊断。
（1）被检样品的稀释：将8只试管排列于试管架上，自第1管开始由左至右用稀释液Ⅰ作二倍连续稀释（即1：6、1：12、1：24……1：768），每管容积0．5mL。
（2）按下述滴加被检样品和对照
a）在血凝滴定板上的第1～5排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0．05mL，每排的第7孔滴加第7管稀释被检样品0．05mL，以此类推至第1孔；
b）每排的第9孔滴加稀释液Ⅰ0．05mL，作为稀释液对照。
c）每排的第10孔按顺序分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-Ⅰ型和猪水泡病标准抗原（1：30 稀释）各0．05mL，作为阳性对照。
（3）滴加敏化红细胞诊断液：先将敏化红细胞诊断液摇匀，于滴定板第1～5排的第1-10孔分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-Ⅰ型和猪水泡病敏化红细胞诊断液，每孔0．025mL，置微量振荡器上振荡1～2min，20～35℃放置1．5～2h后判定结果。
4．2．2．2 使用标准阳性血清进行口蹄疫O型及与猪水泡病鉴别诊断。
（1）每份被检样品作四排、每孔先各加入25μL稀释液Ⅱ。
（2）每排第1孔各加被检样品25μL，然后分别由左至右作二倍连续稀释至第7孔（竖板）或第11孔（横板）。每排最后孔留作稀释液对照。
（3）滴加标准阳性血清：在第1、3排每孔加入25μL稀释液Ⅱ；第2排每孔加入25μL稀释至1：20 的口蹄疫O型标准阳性血清；第4排每孔加入25μL稀释至1：100 的猪水泡病标准阳性血清；置微型混合器上振荡1～2min，加盖置37℃作用30min。
（4）滴加敏化红细胞诊断液：在第1排和第2排每孔加入口蹄疫O型敏化红细胞诊断液25μL；第3排和第4排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液25μL；置微型混合器上振荡 1～2min，加盖20～35℃放置2h后判定结果。
