5．2．3．3 分光光度计，能在340nm波长处检测。
5．2．4 采样
同5．1．4。
5．2．5 分析步骤
5．2．5．1 试液制备
量取50．0mL样品到100mL容量瓶中，用水稀释到刻度后混匀。
5．2．5．2 纯化
吸取10．0mL试液(5．2．5．1)于50mL锥形瓶中，依次加入1．75mL亚铁氰化钾溶液(5．2．2．6)、1．75mL硫酸锌溶液(5．2．2．5)和6．5mL缓冲液A(5．2．2．9)。每加入一种溶液后，充分振荡均匀。全部溶液加完后，静置10min，过滤，弃去最初的1mL～2mL滤液，收集滤液。
5．2．5．3 水解乳糖和乳果糖
吸取5．00mL滤液于10mL容量瓶中，加入50μL的β—D—半乳糖苷酶悬浮液(5．2．2．12)，混匀后加盖。在40℃水浴或干燥箱培养至少10h。
5．2．5．4 葡萄糖氧化
依次加入2．0mL缓冲液C(5．2．2．11)、100μL葡萄糖氧化酶悬浮液(5．2．2．13)、1滴辛醇(5．2．2．3)、0．5mL浓度为0．33mol／L氢氧化钠溶液(5．2．2．7)、50μL过氧化氢(5．2．2．2)和 0．1mL过氧化氢酶悬浮液(5．2．2．14)，每加入一种试剂均要摇匀。全部溶液加完后，在40℃水浴或干燥箱中培养3h。冷却后稀释至10mL，过滤，弃去最初的1mL～2mL滤液，收集滤液。
5．2．5．5 空白
依照5．2．5．1到5．2．5．4步骤处理空白溶液，但不加β—D—半乳糖苷酶悬浮液(5．2．2．12)。
5．2．5．6 测定
测定步骤见表2。
表2 测定步骤
┌──────────────────────────┬─────┬─────┐
│ 步骤 │ 空白 │ 样品 │
├──────────────────────────┼─────┼─────┤
│比色皿中依次加入： │ │ │
│ 缓冲液B(5．2．2．10) │1．00mL │1．00mL │
│ ATP溶液(5．2．2．17) │0．100mL │0．100mL │
│ NADP溶液(5．2．2．18) │0．100mL │0．100mL │
│ 滤液(5．2．5．4) │1．00mL │1．00mL │
│ 水 │1．00mL │1．00mL │
├──────────────────────────┴─────┴─────┤
│混合均匀后，静置3min │
├──────────────────────────┬─────┬─────┤
│加入己糖激酶／葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(5．2．2．15)│20μL │20μL │
├──────────────────────────┼─────┼─────┤
│混合均匀，等反应停止后(约10min)，记录吸光值 │A(b1下标) │A(s1下标) │
├──────────────────────────┼─────┼─────┤
│加入磷酸葡萄糖异构酶悬浮液(5．2．2．16) │20μL │20μL │
├──────────────────────────┼─────┼─────┤
│混合均匀，等反应停止后(10min～15min)，记录吸光值 │A(b2下标) │A(b2下标) │
├──────────────────────────┴─────┴─────┤
│注1：以上反应均在同一比色皿中完成。 │
│注2：如果1mL滤液吸光值增加超过1．3，则减少样品滤液取样体积，注意增加水以保证│
│比色皿中反应液总体积不变。 │
└──────────────────────────────────────┘
