6、标本的检测和结果反馈程序
病例调查及标本 县CDC实验室：标本处理，病例调查 省级CDC实验室：检测 国家CDC：疑难病例、分离毒株。
附件2：
狂犬病实验室检测技术指南
1、实验室条件及生物安全操作要求
（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必须立即报告本部门负责人。
（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。
（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。
（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。
（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。
（6）实验后要作好善后消毒处理，狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。
2、实验室检测网络组成及职责
（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。
（2）中国疾病预防控制中心职责
A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；
B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；
C.对各级实验室检测人员进行技术培训。
D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。
（3）省级疾病预防控制中心职责
A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。
B.辖区内各种标本的实验室检测。
C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。
（4）县级监测点疾病预防控制中心职责
采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。
3、实验室检测方法
（1）病原检测：
A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。
B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200μl/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃ l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。
（2）核酸检测：
RT-PCR方法：以特异性扩增核蛋白（N）基因最保守区域为目的基因，设计一对引物：N1（＋）：5’-587TTT GAG ACT GCT CCT TTT G605-3’；N2（-）：5’-1092CC CAT ATA GCA TCC TAC605-3。唾液、脑脊液、皮肤或脑组织标本以及感染病毒后的细胞培养物或鼠脑均可用于病毒核酸的检测。基本步骤为：待检标本用细胞总RNA分离试剂提取病毒RNA，再通过逆转录反应合成与目的基因RNA序列互补的cDNA，PCR循环特异性扩增目的基因cDNA，电泳检测PCR扩增产物，判断检测结果。
