调查日期：__________________________ 调查者：____________________
附表6：
伊蚊登革病毒分离送检登记表
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│ 编号 │捕蚊日│ 地点 │是否病│ 数量 │ 蚊种 │备注│
│ │ 期 │ │ 家 │ │ │ │
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│ │ │ │ │ │ │ │
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│ │ │ │ │ │ │ │
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送检单位：_______________________________________________________
送检人：______________________ 送检日期：_______________________
接收单位：_______________________________________________________
接收人：_____________________ 接收日期：_______________________
附表7：
疑似登革热病人检材送检一览表
┌─┬──┬─┬─┬─┬──┬──┬──┬──┬──┬──┬──┬─┐
│编│患者│性│年│职│住址│联系│临床│发病│取材│检材│检验│备│
│号│姓名│别│龄│业│ │电话│诊断│日期│日期│种类│项目│注│
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│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
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│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
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送检单位：___________________________________________________
送检人： ______________ 送检日期：__________________________
接收单位：___________________________________________________
接收人：_____________________________________________________
附表8：
病原学检测结果一览表
监测点名称： 国标码：□□□□□□
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│标本│标本│采集│采集人│ 检测结果 │型别│检测日期│检测人│
│编号│类型│日期│ ├──┬──┬──┤ │ │ │
│ │ │ │ │核酸│病毒│序列│ │ │ │
│ │ │ │ │检测│分离│测定│ │ │ │
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注：对于核酸检测中的序列测定，报送结果中应包括原始测序彩图文件和序列文件的电子版拷贝。
填表时间：______年___月___日 单位（盖章）：______________；
填表人：_________________
附表9：疑似登革热病例送检表（临床）
送检单编号：___________
┌─────────────────────────────────┐
│ 疑似登革热病例送检单 │
│ 送检或住院号：____________ 检验室编号：____________ │
│ 姓名：____________ 性别：______ 年龄：________ │
│ 地址：____________________________________ │
│ 入院日期：____________ 发病日期：____________ │
│ 临床诊断：____________ │
│入院主诉：________________________________________________ │
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│ │
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│临床表现： │
│1.发热：______℃（最高）持续：______天 │
│2.头痛：（1）有；（2）无 │
│3.关节、肌肉痛：（1）有；（2）无 │
│4.束臂试验：______，皮肤淤点：______ 鼻衄：______ 呕血：_____│
│_ 其它出血：______ │
│5.血压：______kPa │
│6.脉搏：______/分钟 │
│流行病学史： │
├─────────────────────────────────┤
│临床化验： │
│血小板：______×109（起病后第______天） │
│红细胞压积：_________________ │
├─────────────────────────────────┤
│血标本： │
│采血日期：___________（1）入院时 （2）出院时 （3）恢复期 │
│检测项目：（1）登革热病毒分离 （2）登革热抗体检测 │
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│ │
├─────────────────────────────────┤
│送检医师：__________单位：_____________________________ │
│送检日期：_______________ │
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附件1：
免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体
试验材料：
（1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存；
（2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）；
（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体；
（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；
（5）荧光显微镜。
检测步骤：
（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断：
细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义：
阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义；
恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA）
检测单份和/或双份血清IgG抗体
试验材料：
（1）抗原：
阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；
（3）缓冲液：
包被液：pH9.6碳酸缓冲液；
稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶）
洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；
（4）显色液：A/B液
（5）终止液：4NH2SO4
（6）酶标板、酶标仪。
检测步骤：
（1）用包被液按工作浓度稀释抗原，100μl/孔，4℃过夜；
（2）弃去包被液，用PBS-T重复洗涤3～5次，甩干；
（3）将待检血清用稀释液从1：100开始作2或4倍连续稀释，加入抗原孔，100μl/孔，同时设阴、阳性对照，37℃水浴1小时；
（4）弃去血清，用洗涤液洗涤5～6次；
（5）加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀释，100μl/孔，37℃水浴1小时；
（6）弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干；
（7）加显色液：于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；
（8）加终止液于每反应孔，100μl/孔。
结果判断：
于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgG抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）
意义：
阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：100有诊断参考意义；
恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件3：IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体
试验材料：
（1）抗原：
阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）抗人IgM（μ链）单克隆抗体或多克隆抗体；
（3）登革病毒IgM阳性、阴性对照血清；
（4）辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体；
（5）缓冲液：
洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；
稀释液：pH7.4PBS（5％牛血清）；
封闭液：pH9.6碳酸缓冲液（1％牛血清白蛋白）；
（6）显色液：A/B液
（7）终止液：4NH2SO4
（8）酶标板、酶标仪。
检测步骤：
（1）用稀释液按效价稀释抗人μ链单克隆抗体，100μl/孔，加盖，4℃过夜；
（2）弃去抗人μ链，用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；
（3）弃封闭液，用洗涤液重复洗3次，甩干。
（4）将待检血清用稀释液从1：10开始作2或4倍连续稀释，加入酶标板孔中，100μl/孔，同时加入已1：10稀释的阳性血清、阴性血清对照各4孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；
（5）弃去血清，用洗涤液重复洗3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，100μl/孔，4℃过夜；
（6）弃抗原，用洗涤液重复洗3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗原加4个型混合的酶标单克隆抗体，100μl/孔，37℃水浴2小时；
（7）弃去标记物，用洗涤液重复洗3次，甩干，于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；
（8）加终止液于每反应孔，一滴/孔。
结果判断：
（1）目测方法：
阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。
（2）酶联免疫检测仪检测：
于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）
意义：
阳性结果，表明患者新近DV感染，用于登革热早期诊断。
附件4：C6/36（或BHK21）细胞分离登革热病毒
标本：
（1）患者血清：无菌采集发病后5日内登革患者静脉血3ml，分离血清，接种细胞培养；不能及时接种细胞者可置-70℃保存。污染的血清要加双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/ml），4℃2小时处理后接种细胞。
（2）尸检材料：脑、肝等。
（3）蚊：采集吸过血的伊蚊或其它可疑媒介蚊，用0.5mol/L（10％）葡萄糖液喂养，至胃血完全消化后置-70℃保存，死后按蚊种及捕获地点分组，5～10只/组，生理盐水冲洗数次后，用研磨器研碎，每组加0.5mlHank’s液，2000转/分钟离心15分钟，取上清加双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/ml），4℃过夜，备用。
病毒分离：
将培养好的单层细胞上清弃掉，用Hank’s液洗涤2遍，接种用Hank’s液稀释成10-1的患者血清0.1ml或组织悬液或蚊悬液0.2ml。C6/36细胞在28℃吸附1小时，BHK21细胞在37℃吸附1小时，补加维持液，C6/36细胞在28℃培养，BHK21细胞在37℃培养。第二天开始观察细胞病变情况。一般BHK21细胞4天左右出现病变，C6/36细胞需要在28℃培养7天。如果没有细胞病变，则盲传3代（每次取细胞悬液0.1ml）接种细胞传代。按附件6进行鉴定。
附件5：乳鼠分离登革热病毒
标本：
同附件4。
病毒分离：
（1）每一检材接种一窝1～2日龄乳鼠，脑内接种0.01ml/只。接种后48小时内死亡者按非特异性死亡处理，弃去。
（2）存活者观察10天，若仍未发病，则解剖其中2只，取脑，用pH8.0肉汤制成10％悬液，盲传一窝1～2日龄乳鼠，存活鼠和盲传鼠均观察到第4周，未发病为阴性结果；
（3）在观察期内发病（活动力降低、站立不稳、肢体抽搐、不全麻痹等症状）者，解剖，取半边脑，按盲传法制成10％悬液，接种一窝1～2日龄乳鼠，并作无菌试验；另半边脑置5.43mol/L（50%）甘油缓冲液中低温保存。无菌试验阴性而重复以上症状者作为可以毒种传代、保存，并按附件6进行鉴定。
附件6：免疫荧光法检测DV抗原
材料：
（1）细胞抗原片的制备：
出现“＋＋”细胞病变的C6/36细胞或BHK21细胞倒去维持液（若盲传无细胞病变出现，仍然按此方法制备），用pH7.2PBS洗涤2次，加PBS用滴管把细胞从管壁上吹下，吹散，2000转/分钟离心5分钟，弃去PBS，沉渣用0.2mlPBS吹散，滴加在抗原片上，吹干，冷丙酮固定10分钟，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存备用；
（2）脑、肝组织片：冷冻切片机切片，吹干，冷丙酮固定10分钟，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存备用；
（3）荧光标记单克隆抗体；
（4）荧光显微镜。
方法：
（1）制备的抗原片或组织片，吹干，按顺序滴加4个型的荧光标记单克隆抗体，2孔/型，对照2孔（加PBS），置湿盒内37℃水浴30分钟；
（2）取出，用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干；
（3）荧光显微镜观察结果。
结果判断：
特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在胞浆中，正常组织细胞呈橙红色或暗红。
意义：
从病人血清、组织或蚊媒中分离出DV或查到抗原，可确诊DV感染和病毒型别。
附件7：RT-PCR检测DV基因及分型
材料：
（1）附件6和分离的DV
（2）引物：（供参考）
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│ 引物 │ 序列（5’～3’） │靶序列（基因）│片段（bp）│
│ │ │ │ │
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│1～4通用引物│＋）GTGCACACATTGACAGAACA │ NS1 │ 539 │
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│ │—）CTTTCTATCCAATAACCCAT │ │ │
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│型特异性引物│ │ │ │
├──────┼─────────────┼───────┼─────┤
│ DEN-1 │＋）GGACTGCGTATGGAGTTTTG │ E-NS1 │ 490 │
├──────┼─────────────┤ │ │
│ │—）ATGGGTTGTGGCCTAATCAG │ │ │
├──────┼─────────────┼───────┼─────┤
│ DEN-2 │＋）GTTCCTCTGCAAACACTCCA │ E │ 230 │
├──────┼─────────────┤ │ │
│ │—）GTGTTATTTTGAGTTTCCTTG │ │ │
├──────┼─────────────┼───────┼─────┤
│ DEN-3 │＋）GTGCTTACACAGCCCTGTTT │ E-NS1 │ 320 │
├──────┼─────────────┤ │ │
│ │—）TCCATTCTCCCAATCTCCTG │ │ │
├──────┼─────────────┼───────┼─────┤
│ DEN-4 │＋）CCATTATGGCTGTGTTGTTT │ NS2a-NS2b │ 398 │
├──────┼─────────────┤ │ │
│ │—）CTTCATCCTGCTTCACTTCT │ │ │
└──────┴─────────────┴───────┴─────┘
