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1.3.2.4 每孔中加入1%（V/V）鸡红细胞悬液25µl，轻轻混匀，2～8℃静置40分钟。
1.3.2.5 结果判定 将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血凝抑制。当阴性血清HI效价不高于1：8、阳性血清HI效价与规定效价相比误差不高于1个滴度时，试验方可成立。以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。
2 H9亚型禽流感血凝抑制试验抗原、阳性血清质量标准及血凝抑制试验操作程序
2.1 H9亚型禽流感血凝抑制试验抗原质量标准
【性状】 微黄色，海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
【无菌检验】 按现行《中国兽药典》附录方法进行，应无菌生长。
【效价测定】 按标识体积稀释后，对1%鸡红细胞凝集价应不低于1：1024。
【特异性】 抗原与AI（H9）阳性血清为阳性反应（HI应不低于1：256），与阴性血清、ND阳性血清、禽流感（H5、H7）阳性血清、减蛋综合征（EDS）阳性血清均为阴性反应（HI应不高于1：4）。
【敏感性检验】 对禽流感阳性血清为阳性反应（HI应不低于1：256），对SPF鸡血清为阴性反应（HI应不高于1：4）。
【剩余水分测定】 按现行《中国兽药典》附录方法进行，应符合规定。
【真空度测定】 按现行《中国兽药典》附录方法进行，应符合规定。
【作用与用途】 用于检测H9亚型禽流感抗体的红细胞凝集抑制试验。
【贮藏与有效期】 2～8℃保存，有效期为12个月。
【规格】 （1） 1ml/瓶 （2） 2ml/瓶
2.2 H9亚型禽流感血凝抑制试验阳性血清质量标准
【性状】 微黄色，海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
【无菌检验】 按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应无菌生长。
【效价测定】 按标识体积稀释后，HI抗体效价应不低于1：256。
【特异性检验】 阳性血清与AI（H9）抗原应呈阳性反应（应不低于1：256），与EDS、ND、AI（H5、H7）抗原应呈阴性反应（应不高于1：4）。
【剩余水分测定】 按现行《中国兽药典》附录方法进行，应符合规定。
【真空度测定】 按现行《中国兽药典》附录方法进行，应符合规定。
【作用与用途】 用于H9亚型禽流感红细胞凝集抑制试验对照。
【贮藏与有效期】 2～8℃保存，有效期为12个月。
【规格】 （1） 1ml/瓶 （2） 2ml/瓶
2.3 H9亚型禽流感血凝抑制试验操作方法
2.3.1 H9亚型禽流感HI抗原工作液配制
2.3.1.1 H9亚型禽流感HI抗原血凝价测定 取96孔V型微量反应板1块，每孔加25µl PBS（0.01mol/L，pH值为7.0～7.4），第一排加25µl抗原，并做2～4个重复孔，然后将抗原进行2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25µl PBS，最后再加入1%鸡红细胞悬液25µl，用微量振荡器混匀，室温（约20℃）静置20～40分钟或2～8℃静置40～60分钟判定结果，以使红细胞100%凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
2.3.1.2 H9亚型禽流感HI抗原工作液配制（4HAU抗原的配制） 根据测定的HI抗原HA效价，用PBS配制4HA单位抗原。将配制好的4HA单位抗原用PBS稀释，使其稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7。在每一稀释度的25µl抗原中加25µl PBS，再加入1%鸡红细胞悬液25µl，混匀，2～8℃静置40分钟，判定结果。如果1∶4稀释为红细胞100%凝集终点，表明配制的是4HA单位抗原；如果红细胞100%凝集终点是1∶5或1∶6，表明配制的4HA单位抗原实际上是高于4个单位；如果红细胞100%凝集终点是1∶2或1∶3，表明配制的4HA单位抗原实际上是低于4个单位。应根据检验结果适当调整，使抗原工作液为4HA单位。
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