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农业部公告第1802号――关于批准青岛宝依特生物制药有限公司等8家单位申报的鸭病毒性肝炎冻干蛋黄抗体等2种兽药产品为新兽药,并核发《新兽药注册证书》的公告

  3.1样品固定取组织样品,浸泡于4%多聚甲醛混合液中,固定24小时。将固定好的组织修成适当大小的块。

  3.2 组织脱水、透明、包埋将固定好的组织取出,稍作修正后,置于脱水筐中,用梯度酒精脱水,70%乙醇过夜,80%乙醇2小时,90%乙醇2小时,95%乙醇1液1小时,95%乙醇2液1小时,无水乙醇1液1小时,无水乙醇2液1小时,无水乙醇3液1小时,冬青油(即水杨酸甲酯)透明过夜。透明完毕后,在蜡缸1缸和2缸中分别浸蜡40分钟。浸蜡后,将组织包埋于旧蜡中。

  3.3 载玻片处理将多聚赖氨酸涂布于免洗载玻片表面,室温自然干燥,放置于载玻片盒中备用。

  3.4 切片、贴片、烤片制备组织切片时,厚度不超过5μm,将切好的组织在42℃水浴中充分展开后,贴于载玻片上,贴片后平放一段时间,贴于载玻片上,贴片后在漂烘仪内烤片30分钟,防止组织脱落,然后置染色架上60℃烤片,过夜。

  3.5 脱蜡将组织切片置于二甲苯1液10分钟,二甲苯2液10分钟,二甲苯∶乙醇(1:1)液5分钟,无水乙醇1液5分钟,无水乙醇2液5分钟,95%乙醇3分钟,90%乙醇3分钟,80%乙醇3分钟,70%乙醇5分钟。最后用蒸馏水浸泡3次,每次5分钟。

  3.6 消除内源性过氧化物酶30%H2O220ml+甲醇溶液180ml混合,室温避光浸泡30分钟。然后用蒸馏水洗3次,每次5分钟。

  3.7 抗原修复将组织切片置柠檬酸钠缓冲液(0.01mol/L,pH值6.0,1000ml中含柠檬酸三钠3g、柠檬酸0.4g)中,在微波炉中高火加热至沸腾,再低火维持20分钟,取出后自然冷却至室温,然后用PBS(0.02mol/L,pH值7.4)清洗3次,每次5分钟。

  3.8 封闭将5%BSA封闭液滴加在组织上,50μl/片,于室温封闭20分钟。

  3.9 加一抗封闭完成后,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,滴加一抗(PCV2Cap蛋白单克隆抗体),置2~8℃冰箱中反应过夜。

  3.10 加二抗将载玻片从冰箱中取出,37℃温箱内复温30分钟。然后放入 PBS(0.02mol/L,pH值7.4)中洗1次,静置3分钟,擦干组织周围的PBS后滴加二抗(羊抗鼠IgG),置温箱37℃感作20分钟。

  3.11 加SABC将样品从温箱中取出,PBS(0.02mol/L,pH值7.4)洗2次,每次5分钟,擦干组织周围的PBS,滴加试剂SABC,37℃作用30分钟。PBS(0.02mol/L,pH值7.4)洗4次,每次5分钟。

  3.12 加显色剂将组织片周围的PBS吸干,每片组织滴加DAB显色液50μl,置室温显色。用蒸馏水终止显色,显色结束后,在PBS(0.02mol/L,pH值7.4)中浸泡10分钟。

  3.13 苏木素复染将显色后的组织用苏木素染液复染3分钟,立即用蒸馏水清洗干净,再用梯度酒清脱水,即70%乙醇5分钟,80%乙醇5分钟,90%乙醇5分钟,95%乙醇1液5分钟,95%乙醇2液5分钟,无水乙醇1液5分钟,无水乙醇2液5分钟,二甲苯1液5分钟,二甲苯2液中充分透明5分钟,取出后在二甲苯未挥发完全时用中性树胶封片,置通风橱中晾干。


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