附件3

　　推荐使用体细胞计数仪进行乳汁体细胞计数。
　　体细胞计数法有直接计数法和间接计数法。直接计数法中简便易行的方法是直接用显微镜进行体细胞计数（SCC），间接计数法就是后面提到的CMT法。
　　1　主要试剂和材料
　　美蓝染色液：美蓝乙醇饱和溶液30mL（美蓝2g，95%乙醇100mL），10%氢氧化钠溶液0.1mL，蒸馏水100mL，将上列溶液混合摇匀，过滤后备用。二甲苯、95%乙醇。生物显微镜、载玻片、10μL 微量加样器（或移液枪）等。
　　2　操作方法
　　2.1 涂片制备
　　涂布：充分摇匀新鲜乳样，用10μL 微量加样器吸取中部乳汁10μL ，或用接种环蘸取等量的乳汁，将乳样滴于玻片一端中侧，仔细涂布成约1cm²面积的乳膜（为便于操作，可在玻片下垫衬一张硬纸板，纸板上用毛笔划数个面积为1cm²的方格透视）。
　　干燥、脱脂、固定：涂好乳膜的玻片于37℃温箱中干燥，然后用二甲苯脱脂5min，再置95%乙醇中固定5～10min。
　　染色：玻片干燥后，用美蓝染色液染色5min。水洗，再用95%乙醇脱色数分钟，水洗干燥后镜检。
　　镜检及计数：在生物显微镜油镜下观察（最好用10×目镜，其视野直径要求为0.016），计数100个视野内的细胞数，然后用下式计算：SCC＝100×N/πr²
　　视野面积πr²＝3.1416×（0.016/2）2＝0.0002cm²，
　　显微镜系数N ＝1/0.0002×100＝500，000，
　　SCC＝系数×每个视野的细胞平均数 （即细胞总数÷100）＝细胞数/mL乳。
　　3　判定标准
　　随着国际和国内乳品行业的接轨，国内标准也在提高，一般以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床乳房炎的临界值（＋）；超过该值为阳性，低于该值则正常。

　　附件4

　　CMT是加州乳房炎试验的简称，即首先在美国加利福尼亚州使用的一种乳房炎检测试验。它是通过间接测定乳中体细胞数（SCC）来诊断隐性乳房炎的方法。其原理是在表面活性物质和碱性药物作用下，乳中体细胞被破坏，释放出DNA，进一步作用，使乳汁产生沉淀或形成凝胶。体细胞数越多，产生的沉淀或凝胶也越多，从而间接诊断乳房炎和炎症的程度。该法是国际通用的隐性乳房炎诊断方法，其特点是简便、快速。我国研制出了类似的方法如BMT（北京奶牛研究所）、SMT（上海奶牛研究所、HMT（黑龙江省兽医科学研究所），以及LMT（中国农科院兰州兽医研究所）等。
　　1　试剂和方法
　　CMT检测中用到的试剂和方法如下：十二烷基磺酸钠30g溶解于1000mL蒸馏水， 用2M的氢氧化钠调节PH等于6.4，加入溴甲酚紫0.1g，即成CMT检验液， 取乳房炎诊断盘1只，滴加被检乳2mL，诊断液2mL，缓缓作同心圆状摆市售成品CMT诊断试剂或者其他方法的成品试剂，按照说明操作。
　　2　判定标准：可以参考表1。

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